4 つの方法を使用した細胞膜の電気的透過の評価 - 石家荘市イルラーゴデイチーニ有限公司

Microsystems & Nanoengineering volume 8、記事番号: 68 (2022) この記事を引用

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80 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞膜の電気的透過は、インピーダンスサイトメトリーによって細胞内部を決定するために不可欠です。ここでは、インピーダンスパルスの傾斜レベルを通じて細胞膜の導電率を決定する方法を提案します。電気的貫通が起こると、高周波電流が細胞膜を自由に通過します。したがって、細胞内分布は高周波インピーダンスパルスに直接作用する可能性があります。数値シミュレーションにより、不均一な細胞内成分分布がインピーダンスパルスの傾斜レベルに影響を与える可能性があり、細胞膜が電気的に貫通されると傾斜レベルが増加し始めることが示されています。実験的証拠は、4 周波数インピーダンスサイトメトリーで細胞集団を測定する場合、検出周波数 (>7 MHz) が高いほど、インピーダンスパルスの傾斜レベルの分布が広くなるということを示しています。この発見により、7 MHz の検出周波数がユーグレナグラシリス (E. gracilis) 細胞の膜を通過できることがわかりました。さらに、単一の E. gracilis 細胞のバイオマスモニタリングにおける 4 周波数インピーダンスサイトメトリーの応用の可能性を提供します。高周波インピーダンス (≥7 MHz) を適用してこれらのバイオマスの変化を監視することができ、低周波インピーダンス (<7 MHz) を適用して対応する生体量の変化を追跡することができます。全体として、この研究は細胞膜の電気的透過の簡単な決定方法を実証しており、提案されたプラットフォームは培養中の細胞状態の多パラメータ評価に適用可能です。

単一細胞のバイオマス評価は、細胞の状態 1 や細胞増殖機構 2、環境問題やエネルギー問題 3,4 の分析など、多くの分野で重要な役割を果たしています。現在までに、生細胞イメージング 5、ラマンフローサイトメトリー 6、化学プローブ 7 などのいくつかの技術が、単一細胞の細胞内バイオマスのハイスループット評価に適用され成功しています。しかし、これらの光学ベースのアプローチのほとんどは時間と労力がかかり、ビーム集束点の保守と校正に対する厳しい要件により、堅牢性と可搬性が制限されます。この研究では、高周波インピーダンス信号の大きさを通じてバイオマスを特徴付けるためのより効果的で便利な方法を提案しました。

代替として、インピーダンスサイトメトリーは、ラベルフリーでコスト効率の高い方法で単一細胞の特性評価に適用できることが実証されています8。現在まで、インピーダンスサイトメトリーは、単一細胞の形態 9、剛性 10、および状態 11 の分析に成功してきました。インピーダンスパルスの大きさと形態は、それぞれ単細胞の体積12と形状13に依存することが示されています。さらに、研究により、高周波インピーダンス検出が膜特性の特性評価に適用できることがわかっています 14,15。たとえば、細胞膜の導電率は検出周波数が 1 MHz を超えると増加し 14、膜の導電率は細胞の生存率に関係します。 Sui ら 16 および Zhong ら 17 は、哺乳類の生細胞の膜に電流を通過させるには 5 ～ 8 MHz の検出周波数で十分であることを示しました。この結論は、不活化細胞と生細胞の間の膜伝導性の違いから導き出されます。不活化細胞に対するベンチマークがなければ、膜が導電性であるかどうかを直接判定する適用可能な方法の報告はほとんどありません。

インピーダンスサイトメトリーで細胞内バイオマスを測定する場合、細胞膜を透過できる検出周波数を決定する必要があります。私たちの解決策は、インピーダンスパルスの傾斜レベルを傾斜指数 13 として定量化し、さまざまな検出周波数での細胞集団の傾斜指数を通じて細胞膜の導電率を評価することです。私たちの以前の研究に基づいて、高周波電流が非導電性細胞内成分間の単一細胞内を伝播する可能性があるため、細胞内成分の分布が高周波インピーダンスパルス（6 MHz）の傾斜レベルに影響を与えることが判明しました18,19。対照的に、低周波電流 (500 kHz) は細胞膜を通過できず、主に細胞の周りを伝播します 18,19。この機能により、インピーダンスパルスのチルトインデックスに基づいてセルの内部と外部の検出周波数を決定するための新しい方法が容易になります。細胞内部は、集団内の形態よりも不均一です。検出周波数が細胞膜を透過するほど十分に高い場合、細胞集団のインピーダンスパルスの傾斜指数はさらに変化します。私たちの知る限り、セル内部の検出周波数を決定するためにインピーダンスパルスの傾斜レベルが使用されたのはこれが初めてです。

この研究では、図1aに示すように、4周波数インピーダンスサイトメトリーを使用して単一ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）細胞の導電率を分析しました。まず、単一の E. gracilis 細胞のさまざまな周波数でのインピーダンス検出を使用して、どの検出周波数で電流が細胞膜を通過できるかを決定しました。高周波電場が細胞膜を貫通すると、不均一な細胞内分布によりインピーダンスパルスが左右に傾きます（図1b参照）。これはシミュレーションや実験で確認されている現象です。さらに、提案された 4 周波数インピーダンスサイトメトリー技術 (つまり、500 kHz、4 MHz、7 MHz、および 10 MHz) を適用して、能力に基づいてさまざまな条件下で 4 日間培養した単一 E. gracilis 細胞のバイオマスをモニタリングしました。細胞内バイオマスを検出するための高周波インピーダンス。 E. gracilis 細胞の内部および外部の電気スキャンでは、有機源または無機イオンを含むさまざまな培養培地に対する細胞反応が明確に示され、細胞は増殖、体積、不透明度に大きな違いを示しました。単一細胞の体積は低周波インピーダンスの大きさによって監視され、それらのバイオマスの変化は高周波インピーダンスの大きさによって追跡されました。インピーダンス検出システムは、自家製のトランスインピーダンスアンプ (図 1d を参照) を備えたフィールドプログラマブルゲートアレイ (FPGA) ボード (図 1c を参照) 上に構築されました。我々は、傾斜指数が細胞膜の電気浸透の頻度を決定するための代替方法を容易にすることができると考えています。さらに、提案されたインピーダンスベースのプラットフォームは、細胞の状態とバイオマスを評価するために採用できます。これは、連続的な細胞培養を伴う実際のアプリケーションで重要です21、22。

E.グラシリス細胞および単一のE.グラシリス細胞のいくつかの重要な構造を検出するためのマイクロ流体インピーダンスサイトメトリー。 b 4 つの異なる周波数 (つまり、500 kHz、4 MHz、7 MHz、および 10 MHz) でのインピーダンス信号、および高周波インピーダンス信号の形態に対する細胞内成分分布の影響。 c インピーダンスアナライザと (d) 自社開発トランスインピーダンスアンプの周波数特性

単一細胞の侵入頻度を決定するために、COMSOL 5.6 Multiphysics ソフトウェア (COMSOL Inc.、米国マサチューセッツ州バーリントン) の AC/DC モジュールを介して 2D 数値シミュレーションを実行しました。ここでは、E. gracilis 細胞を単殻楕円 (半径: 長軸 30 μm、短軸 10 μm) としてシミュレートし、細胞膜 (10 nm) を接触インピーダンス近似を使用してモデル化しました 23。図2aに示すように、細胞内成分は2D円（膜厚20 nm、直径1 μm）として簡略化され、細胞の左側内部に密接して配置されていました18、19。シミュレーションで使用されるセル 18 のその他のパラメーターは、補足情報の表 S1 にリストされています。

a 500 kHz、4 MHz、7 MHz、10 MHz、20 MHz、100 MHz の 6 つの異なる周波数での電位分布。黒い流線の密度は電流密度(A m-2)を示します。 b この研究で使用された 4 つの検出周波数でのシミュレートされたインピーダンスパルス。 c – e 周波数の 3 つのシミュレートされたスペクトルと、（c）チルトインデックス、（d）正規化された幅、および（e）インピーダンスパルスの正規化されたインピーダンス。インピーダンスの大きさとインピーダンスパルスの幅は、低周波インピーダンスメトリックに基づいて正規化されていることに注意してください。

インピーダンス検出では、細胞膜の導電率は周波数に依存し、図2aに示すように、検出周波数が増加するにつれて細胞内の電流密度が徐々に増加します。高周波電流が細胞膜をシームレスに通過することは、細胞内成分の特性評価に高周波インピーダンス検出が適用できることを示しています。シミュレーションでは、細胞内の電流密度の増加は、検出周波数が増加するにつれて細胞膜を通過する高周波電流の能力が強化されることを示しています。

図 2b は、4 つの検出周波数で同じセルモデルに誘導されたインピーダンスパルスを示しています。検出周波数が増加すると、電流の伝播に対するセルモデルの抵抗が減少し、その結果、インピーダンスパルスの大きさが小さくなります。さらに、低い検出周波数 (500 kHz) での対称形状のセルに対応するインピーダンスパルスは対称です。対照的に、右側の中空セル内部は、高い検出周波数で非対称インピーダンスパルスを誘発する原因となります。インピーダンスパルスの右半分は左半分よりも長く続きます。この現象は、インピーダンスパルスの両側の時間幅の比から 1 を引いたものとして定義されるチルトインデックスによって定量化できます (図 2b を参照)。具体的には、500 kHz の対称インピーダンスパルスのチルトインデックスは 0.009 ですが、10 MHz の非対称インピーダンスパルスのチルトインデックスは -0.201 です。チルトインデックスに関するより詳細な情報は、補足情報の図S1に記載されています。

図 2c は、100 kHz ～ 100 MHz の検出周波数に対する傾斜指数の依存性を示しています。すべての傾斜インデックスは、100 kHz の低い検出周波数での値 (ゼロ) に対してベンチマークされます。傾斜指数の増加は、インピーダンスパルスの傾斜レベルに対する細胞内成分分布の影響が増大していることを示します。検出周波数が増加するにつれて、セル全体の右側の内部構造により、インピーダンスパルスが徐々に右に傾きます。約10 MHzでチルトインデックスは極値に達し、その後、細胞内成分が電気的に浸透し始めます（図2aを参照）。比較すると、インピーダンスパルスの幅と大きさ（図2d、eを参照）には、細胞内成分の分布に関する情報がほとんど含まれていません。以前にさまざまな研究で実証されているように、細胞膜の抵抗が減少するため、検出頻度が増加すると両方の値が減少します 8,24。

細胞内部は、集団内の形態よりも不均一です。不均一な内部構造により、電場が細胞膜を貫通し始めると、傾斜指数がますます分散化します。 10μmビーズ、中空セル、左中空セル、右中空セルを含む4つの異なるモデルを使用して測定されたチルトインデックスの周波数依存性のシミュレーション結果を図3a〜cに示します。 100 kHz ～ 100 MHz の範囲の検出周波数では、電流は非導電性ビーズを通過できません。したがって、ビーズのインピーダンスパルスは常に形状が対称であり、傾斜指数はゼロのままです（図3bを参照）。対照的に、中空細胞のインピーダンスパルスの形状は、電流が細胞膜を通過すると非対称になります。たとえば、約 100 kHz を超える検出周波数では、チルトインデックスはゼロから増加し始め、約 10 MHz で最大値に達します。この現象によれば、セル内の電流の伝播によりインピーダンスパルスの非対称形状が生じる可能性があります。

a 10μmビーズ、中空セル、左中空セル、右中空セルの4種類のシミュレーションモデルに基づく、500kHzと10MHzの2つの異なる周波数における電位分布解析。 b 10 μm ビーズと中空セルによって引き起こされる傾斜指数の周波数依存性。 c 4 種類のシミュレーションモデルすべてによって引き起こされるチルトインデックスの周波数依存性。 d、eは、（d）10μmポリスチレンビーズおよび（e）100 kHz、200 kHz、300 kHz、400 kHz、500 kHzを含む12の異なる検出周波数でのE. gracilis細胞によって誘発されたチルトインデックスの実験結果のバイオリンプロット。 kHz、4MHz、7MHz、10MHz、11.5MHz、13MHz、14.5MHz、16MHz

さらに、細胞膜の内側に成分がある場合、インピーダンスパルスの傾斜レベルは、細胞内部が空洞である場合よりも顕著になります（図3cを参照）。したがって、細胞膜内には細胞小器官や高分子などの細胞内成分が常に存在するため、実際の検出では細胞膜によって引き起こされる傾斜指数は無視できます。さらに、チルトインデックスは、検出頻度が増加するにつれて細胞内成分分布への依存性を示します。右中空セルモデルと左中空セルモデルによって引き起こされる傾斜指数の値には、符号を除いてほとんど違いがありませんでした。左中空構造によりインピーダンスパルスが左に傾くため、検出周波数が膜を貫通するのに十分な場合、左中空セルモデルで測定されたチルトインデックスは常に正になります。右中空セルの場合、傾斜インデックスは常に負になります。細胞内成分が高周波電場によって分極される前に、左中空細胞モデルまたは右中空細胞モデルによって引き起こされる傾斜指数の差が徐々に増加します。また、この差が生じているということは、細胞膜が電気的に貫通されていることを示しています。

図 3d、e は、それぞれ E. gracilis 細胞と 10 μm ビーズによって誘発される傾斜指数を示しています。 4 周波数インピーダンスサイトメトリーを使用して、12 の異なる検出周波数で単一細胞または粒子を測定しました。 3 つの独立した測定が行われ、最初のセットの検出周波数は 500 kHz 以内 (つまり、100 kHz、200 kHz、300 kHz、400 kHz)、2 番目のセットは 500 kHz と 10 MHz の間 (つまり、500 kHz、400 kHz) に適用されました。 MHz、7 MHz、10 MHz）、10 MHz を超える 3 番目のセット（11.5 MHz、13 MHz、14.5 MHz、16 MHz）です。非導電性ポリスチレンビーズの場合、13 MHz より低い周波数が適用されると、その傾斜指数は安定した範囲内で変化しました。その後、検出頻度が高くなると、チルトインデックスの分布がより分散されるようになりました。これは、検出周波数 (>13 MHz) が当社のインピーダンス検出システムの上限を超えているためと考えられます。 E. gracilis セルの場合、チルトインデックスは 7 MHz から分散し始めます。したがって、細胞膜の電気的貫通が起こります。ポリスチレンビーズのチルトインデックスと比較すると、周波数が13MHz以下であればデバイスの影響を排除できます。

図3cとeを比較することにより、傾斜指数の分散の増加は細胞膜の電気的浸透を示していると結論付けることができます。この研究では、細胞内成分を検出するために細胞膜を透過するには、7 MHz の周波数で十分です。私たちの以前の調査結果もこの結論を裏付けています18、19。

細胞膜の電気透過周波数を決定した後、光混合栄養培養中の E. gracilis 細胞の体積変化を追跡するために、低周波インピーダンスメトリック (つまり、500 kHz および 4 MHz) と高周波インピーダンスメトリック (つまり、7 MHz と 10 MHz) を使用してバイオマスの蓄積を監視します。 E. gracilis 細胞を Koren-Hutner (KH) 培地で 4 日間培養し、インピーダンス信号を使用して光混合栄養的に増殖した E. gracilis 細胞のバイオマス蓄積を測定しました。 E. gracilis 細胞のインピーダンス検出は、補足情報のムービー S1 と図 S2 に示されています。この研究では、10 MHz の最大検出周波数が使用されました。これは私たちのシステム内でうまく機能し、セル内部の分析にも一般的に使用されています8。最低の検出周波数 (500 kHz) は、単一細胞の体積と形状を特徴付けるために以前の研究で利用されました 18,19。 2 つの中間周波数、つまり 4 MHz と 7 MHz は、3 MHz の間隔に基づいて選択されました。

E. gracilis 細胞は、光混合栄養培養において、光合成または培養培地 (KH 培地) 中の有機炭素源の消化により急速に増殖し、パラミロンを蓄積します。 KH培地で4日間培養したE. gracilis細胞を図4a)に示します。図4bに示すように、E.グラシリス細胞の数は4日間の培養にわたって増加し続け、約241細胞/μLから1936細胞/μLまで増加した。さらに、E. gracilis 細胞のバイオマスは 2.4 mg/mL から 8.5 mg/mL に急速に増加しました。 3 日目の突然の低下は、測定エラーによるものである可能性があります。

a 4 日間の実験における E. gracilis 細胞の体積の比較。スケールバーは10μmを示します。 b E. gracilis 細胞の細胞増殖とバイオマス蓄積の統計分析。 c 4つの検出周波数（500 kHz、4 MHz、7 MHz、10 MHz）でのE. gracilis細胞の電気直径の変化の時間経過。 d E. gracilis 細胞の電気的不透明度の変化の時間経過

図4cに示す単一細胞のインピーダンス特性評価では、E. gracilis細胞のすべての誘電特性が10μmビーズの誘電特性を使用して校正されました。 4 日間の培養期間にわたって、500 kHz での細胞の電気直径は約 10.89 ～ 11.46 に増加しました。これは、低周波インピーダンス値がセルの体積に依存するためです。低周波の電気的直径の増加は、セルの体積の増加を示します8、18、19、24、25。最高の検出周波数 (10 MHz) では、電流が細胞膜を自由に貫通し、細胞内成分 (パラミロンと葉緑体など) の間の細胞質内を伝播するため、高周波電気直径を個体の細胞内非導電性バイオマスに関連付けることができます。細胞。したがって、低周波直径と高周波直径の両方の増加は、最初の 2 日間で体積とバイオマスがわずかに増加したことを示しています。

図4dでは、新しい培養条件が前培養条件と同じであるため、細胞の電気的不透明度（1〜4日目）は前培養のもの（0日目）とほぼ同じです。ただし、高周波電気直径（つまり 7 ～ 10 MHz）の増加は、2 日目に発生した低周波（つまり 500 kHz）電気直径の増加よりも早く、初日に発生しました（参照図4c)。これは、E. gracilis 細胞を新鮮な培地に移したときに、適切な有機栄養素と無機イオンが細胞増殖の前に細胞内成分の生成を誘導したためと考えられます。詳細には、E. gracilis 細胞の増殖速度は培地中の Mg2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+ イオンによって加速され 26、細胞増殖は葉緑体の増殖よりわずかに遅れて起こります。 E. gracilis 細胞の場合、各細胞内の葉緑体の数は比較的安定しており、10 ～ 2027 個の範囲で変化します。細胞あたり 60 個以上の葉緑体がある場合、通常、細胞増殖が発生します 28,29。したがって、E. gracilis 細胞は増殖する前に細胞内バイオマスが増加する可能性があり、その結果、低周波電気直径と比較して高周波電気直径がわずかに早く増加します。

一部の無機金属イオンは E. gracilis の細胞増殖に必要であり、バイオマス合成中に安定化されます 26,30 が、自然環境では有機物の供給が不十分である可能性があります。したがって、E. gracilis 細胞は光独立栄養的に成長する必要があり、そのバイオマスの大部分は炭素源として空気中の二酸化炭素を使用する光合成によって生産されなければなりません 31,32。細胞増殖およびバイオマス蓄積に対する無機イオンの影響を分析するために、E. gracilis 細胞を対照として 1× PBS 溶液中で培養しました。 PBS および Cramer-Myers (CM) 培地で培養した E. gracilis 細胞の誘電特性、細胞増殖、バイオマス蓄積を比較し、図 5 に示します。

増殖培地に有機炭素源を含まない場合、PBSおよびCM培地で4日間培養したE. gracilis細胞を図5aに示します。空気中の炭素源は限られているため、生成されるパラミロンの合成は制限されていました。したがって、E. gracilis 細胞を CM 培地および PBS 溶液に移すと、細胞は蓄積エネルギー (パラミロン) を消費し始め、バイオマスの減少につながりました。さらに、細胞増殖に対する無機イオンの効果を図5bに示します。炭素源が不十分であるにもかかわらず、CM 培地中の E. gracilis 細胞は、PBS 溶液中の細胞よりも頻繁に分裂しました。この結果は、E. gracilis の細胞増殖に対する無機イオンの促進効果に関するいくつかの研究結論も裏付けています 33,34,35。

ＣＭ培地にはＰＢＳ培地よりも多くの細胞が存在したが、細胞のバイオマスはどちらの場合もほぼ同じであった。言い換えれば、CM培地で培養された個々の細胞は、PBS溶液で培養された細胞よりもバイオマスが少ない可能性があります。この結論は、図 5c に示すように、インピーダンス検出によってさらに確認されました。４日間の培養後、４つの検出周波数において、ＰＢＳ溶液中のＥ．グラシリス細胞の電気直径は、ＣＭ培地中の細胞の電気直径よりも大きかった。これは、PBS溶液中のE. gracilis細胞は、CM培地で培養した細胞と比較して、低周波電気直径が大きいため体積が大きく、電気的不透明度が高いため細胞内成分がより高密度であることを示しました（図5dを参照）。

さらに、細胞の電気的直径と電気的不透明度も、培養培地の変化を示す良い指標となります。 E. gracilis 細胞を新鮮な培養培地に移した場合、特に PBS 溶液中での細胞の電気的直径と不透明度は、培養初日に急速に減少しました。これは、細胞の浸透圧と pH 値の変化に関連している可能性があります。培養培地。これらの新しい環境に適応して 2 日後、E. gracilis 細胞の電気的不透明度と直径は正常に戻りました。

CM培地、KH培地およびPBS溶液におけるE. gracilis細胞の増殖条件を考慮すると、いくつかの無機イオンが細胞増殖に寄与している可能性があると結論付けました。特に、E. gracilis 細胞が十分な有機および無機源を備えた環境で増殖すると、その増殖速度と細胞バイオマス生産性は最大値に達します。無機イオンは細胞内に蓄積する可能性があり 36,37、得られたバイオマスはバイオディーゼルの供給源として貴重です。

この研究では、検出周波数が細胞膜を貫通するのに十分であるかどうかを判断するために、インピーダンスパルスの傾斜レベルの分布を利用する方法を提案しました。高い検出周波数では、細胞内成分の分布によりインピーダンスパルスが傾く可能性があり、これはシミュレーションと実験で検証されています。実験結果は、細胞膜の電気的貫通が起こると、検出頻度が増加するにつれて傾斜指数の分布が徐々に分散することを示しました。研究により、7 MHz の検出周波数が E. gracilis 細胞の細胞膜を貫通するのに十分であることが判明しました。

E. gracilis の生きた細胞には、バイオマスの大部分を占める 2 種類の細胞内成分、すなわちパラミロンと葉緑体が存在します。バイオディーゼル源としてのパラミロン 38,39 は、個々の E. gracilis 細胞の乾燥重量の 50% (w/w) 以上を占めます 40。バイオディーゼルのもう 1 つの供給源は、バイオマスの約 22% を占める葉緑体の膜です。環境に優しく持続可能な代替手段として、バイオマスエネルギーは科学界と産業界の両方で大きな関心を引き起こしています4,41。例えば日本では、微細藻類ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）の細胞から作られたバイオディーゼルが「次世代の再生可能燃料」としてシャトルバスや民間航空機に使用されている42。微細藻類細胞は不均一であり、そのバイオマス生産性は成長条件によって異なるため、培養プロセス中のバイオマス蓄積を監視するには効率的な技術が必要です。この研究では、インピーダンスサイトメトリーがE. gracilis細胞の細胞形態および細胞内成分の分析に適用できることが示されました。さらに、将来的には、哺乳類細胞や生物医学の分野や環境の分野で重要な他の種類の細胞も解析される予定です。

E. gracilis 細胞の細胞内成分の場合、個々のパラミロン分子は生体膜に包まれており、多くの場合高い結晶化度を示し、これが理論的には高い電流耐性に寄与しています 33,43。葉緑体は二重膜細胞小器官であり、単一膜細胞と比較して同じ検出周波数でより高い電流抵抗をもたらします。細胞内バイオマスを評価するには、細胞内部を検出できる検出頻度を決定する必要があります。この研究では、E. gracilis 細胞の細胞膜を透過するには 7 MHz で十分であることを報告しました。しかし、さまざまな細胞小器官や生体分子の誘電特性はまだ不明です。単純化した数値モデルによれば、細胞内成分は10MHzで偏光できるが、実験ではこの周波数では不十分である。したがって、より正確なシミュレーションを行うには、細胞内成分の誘電パラメータをさらに検討する必要があります。

多周波インピーダンスサイトメトリーは、単一細胞の検出と分析に広く使用されています5、8、44。さらに、高周波電流は細胞膜を通って伝播する可能性があるため、高周波インピーダンス値が細胞内成分に関連していることはよく知られています24。電流の伝播は細胞内では目に見えないため、検出周波数が細胞内部の成分の測定に適用できるかどうかを判断する直接的な方法がありません。この研究では、細胞内成分の分布を細胞膜の電気的透過を決定するために使用できることを提案しました。具体的には、膜の電気的貫通が発生すると、検出頻度が増加するにつれて傾斜指数分布の分散が増加します。これは、細胞内部が集団内の形態よりも不均一であるためです。不均質な内部構造により、傾斜指数はますます分散化されます。

ここでは、低周波インピーダンスを使用して単一細胞の形態と体積の性能分析を実施し、高周波インピーダンスを使用して細胞内バイオマスを特徴付けました。この検出メカニズムは、これまでの数多くの研究によってサポートされています。我々のこれまでの研究では、低周波電流は主に細胞の周りを伝播するため、低周波検出が細胞形態の分析に適用できることが示されています13、18、19。低周波インピーダンスのセル体積への依存性も検証されています8。さらに、高周波インピーダンスを使用して、細胞内成分の量 19、分布 18、密度 19,45 を分析できることが実証されています。ここで、インピーダンスベースのバイオマス分析は、細胞内成分の量と密度をモニタリングするための高周波インピーダンスの適用性に基づいており、これは実験結果によっても証明されています。

最後に、提案されたインピーダンスベースのプラットフォームは、E. gracilis 細胞の増殖 (体積、不透明度、数) およびバイオマス蓄積に対する培養条件の影響を評価するのに適用できることが示されました。高周波インピーダンスの大きさ（≧7 MHz）はバイオマスの蓄積を特徴付けるために適用でき、低周波インピーダンスの大きさ（≦4 MHz）は単一細胞の体積の定量化を可能にします。バイオマスの蓄積とさまざまな培地での培養の変化を 4 日間にわたって監視することに成功しました。将来的には、細胞の老化、発がん、または溶解に関する膜特性の変化を追跡するために、ティルトインデックスの適用を哺乳類細胞に拡張することを提案します。

実験は、国立環境研究所（NIES、日本）の微生物培養コレクションから提供されたE. gracilis NIES-48細胞で行われました。培養物は、28℃で連続照明（温白色、130〜150μmol/m2/s）下で、作業容量13mLの培養管で増殖させました。バイオマスおよび個々の細胞の代謝に対する有機栄養素の影響を研究するために、E. gracilis 細胞を KH 培地 (pH: 3.5) を使用して光混合栄養的に増殖させました 46。細胞増殖に対する無機イオンの影響を研究するために、E. gracilis 細胞を CM 培地 (pH: 3.9) を使用して光独立栄養的に培養しました 47。 E.グラシリス細胞を、対照群として1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH:6.9)を使用して培養した。 CM および KH 培地の詳細な成分は Wang らによって説明されています 35。簡単に言うと、CM 培地には有機炭素源が含まれていませんが、KH 培地には炭素源としてグルコースとさまざまな有機酸およびアミノ酸が含まれています 48。 KH 培地と CM 培地の両方には、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Co2+、Ni2+ などの無機イオンが高濃度で含まれており、その一部はバイオマスの蓄積と E. gracilis 細胞の増殖を促進する可能性があります 36,49。

キャリブレーションには、10 μm ポリスチレンビーズ (Polysciences、米国) を参照粒子として使用しました。これは、その物理的特性が周波数に依存しないため、完全な絶縁体と見なすことができます。理論的には、ビーズの 4 つの周波数インピーダンスの大きさは同一であるはずです 44。

すべてのサンプルを1×PBSに移し、シリンジポンプ(NIHON KOHDEN CFV-3200)を使用してマイクロ流体デバイスに注入した。サンプル流量は 4.5 μL/分で、この作業ではインピーダンス検出のスループットは約 1250 サンプル/秒となりました。通常、各実験は 3 回反復して実行されました。つまり、図 S3 では、各細胞培養状態ごとに 3 つの細胞培養グループがありました。

実験は、CM 培地、KH 培地、および 1 × PBS 溶液について 4 日間 (つまり、0 ～ 4 日) にわたって行われ、各グループには、確実な特性評価のために E. gracilis の 3 つの独立した培養物が含まれていました。 E. gracilis 細胞の増殖を、細胞数、乾燥重量、細胞体積、および不透明度に従って分析しました。ここでは、E. gracilis 細胞の乾燥重量は、100 °C で 4 時間 50 分以上乾燥させた培養液 0.4 mL を使用して測定しました。細胞の体積は低周波電気直径 (\(\left| {Z_{LF}} \right|^{1/3}\)) を使用して決定され、細胞内成分の体積は高周波を使用して決定されました。電気直径 (\(\left| {Z_{HF}} \right|^{1/3}\))18. 補足情報の図S3に4日間の培養管内の色の変化を示しますが、細胞数が増えるにつれて培養管内の緑色が濃くなっています。

検出領域のポリジメチルシロキサン (PDMS) マイクロチャネルは幅 40 μm、深さ 35 μm です。チャネルは 2 対の共面電極上に配置され、各対は 1 つのソース電極と 1 つの検出電極で構成されます (寸法: 幅 30 μm、エッジ間スパン 30 μm、およびペアスパン 80 μm)。各電極は、厚さ 70 nm のクロム (Cr) 層の上に、厚さ 70 nm の金 (Au) 層でコーティングされています。完全な製造手順は、以前の研究で詳細に説明されました13、18。

図1cに示すように、フィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）ベースのロックインアンプ（Diligent Eclypse Z7、米国）を使用して、4つの検出周波数（つまり、500）で1 Vの交流（AC）信号を生成しました。 kHz、4 MHz、7 MHz、10 MHz）を検出し、検出エリアからのインピーダンス信号 13、20 のリアルタイム処理を実行します。 2つの検出電極からの電流信号を自社開発のトランスインピーダンスアンプ(I/V変換器)で電圧信号に変換し、差動アンプ(Diff)で比較しました。結果として得られた差動電圧は、FPGA ボード上でさらに処理されて、対応するインピーダンス信号が取得されました。すべてのインピーダンス信号は、データ収集デバイス (USB-6363 BNC、National Instruments、米国) を使用して 62.5 kHz のサンプリングレートで記録され、NI DAQExpress (National Instruments、米国) を通じてコンピュータにリアルタイムで表示されました。このデバイスをインピーダンス検出に使用するための実験手順は、補足情報の図S4に示されています。図 1d では、I/V コンバータの周波数応答は、最大 18.48 MHz の電流信号を安定して変換できる能力を示しています。検出周波数が 10 MHz を超えると、増幅率 (ゲイン) が低下し始めました。

インピーダンス信号は、MATLAB (バージョン 2021b、MathWorks、米国) で書かれたカスタムスクリプトを使用して処理されました。各ビーズまたは E. gracilis 細胞のインピーダンス (|Z|) は、単一ピークガウスフィットを使用して決定され、適用された各周波数のピーク信号振幅を抽出しました。 4 つの周波数における 10 μm ビーズの平均インピーダンスの大きさが自動的に決定され、E. gracilis 細胞の電気的直径を校正するために使用されました。 E. gracilis 細胞の平均電気的不透明度 (|ZHF|/|Z500kH|) と直径 (\(\left| Z \right|^{1/3}\)) は、平均値が確実に得られるように単一の線形乗算器を使用して正規化されました。ビーズの両方のインピーダンスパラメーターの値は、各周波数で不透明度 = 1 および直径 = 10 でした。さらに、E. gracilis 細胞の形態と細胞内分布は、左半分と右半分の時間幅 (TLeft⁄TRight − 1) を比較することにより、傾斜指数 (TLeft⁄TRight − 1) を使用して、それぞれ低周波数と高周波数で評価できます。 ) のインピーダンスパルス18。

Zangle, TA、Burnes, D.、Mathis, C.、Witte, ON & Teitell, MA 抗原特異的細胞毒性中の単一 CD8+ T 細胞のバイオマス変化を定量化。 PLOS ONE 8、e68916 (2013)。

記事 Google Scholar

Rhind、N. セルサイズの制御。カー。バイオル。 31、R1414–R1420 (2021)。

記事 Google Scholar

Petrus, L. & Noordermeer, MA バイオマスからバイオ燃料へ、化学的観点から。緑。化学。 8、861–867 (2006)。

記事 Google Scholar

シンドゥ、R.ら。バイオマスからのバイオ燃料生産: 持続可能な開発に向けて。バイオテクノロジーの現在の発展。そしてBioeng: 廃棄物処理。エネルギー生成のプロセス 79–92 (2019) https://doi.org/10.1016/B978-0-444-64083-3.00005-1。

三上宏ほか仮想凍結蛍光イメージングフローサイトメトリー。ナット。共通。 1162年11月（2020年）。

記事 Google Scholar

Gala de Pablo , J. 、Lindley , M. 、Hiramatsu , K. & Goda , K. ハイスループットラマンフローサイトメトリーとその先へ。準拠化学。解像度 54、2132–2143 (2021)。

記事 Google Scholar

太田直樹ほかパラミロン生合成のラマン分析のためのガラスマイクロ流体工学による単一ユーグレナ・グラシリス細胞の単離。アナル。化学。 91、9631–9639 (2019)。

記事 Google Scholar

Honrado, C.、Bisegna, P.、Swami, NS & Caselli, F. 単一細胞マイクロ流体インピーダンスサイトメトリー: データ分析を使用した生シグナルから細胞表現型まで。ラボオンチップ (2021) https://doi.org/10.1039/d0lc00840k。

Zhong, J.、Liang, M. & Ai, Y. 二重差動電極を使用したマイクロ流体インピーダンスサイトメトリーにおけるサブミクロン精度の粒子特性評価。ラボオンチップ (2021) https://doi.org/10.1039/D1LC00481F。

Kim, J.、Li, B.、Scheideler, OJ、Kim, Y. & Sohn, LL 粘結節細孔センシング: 上皮細胞の粘弾性特性を特徴付けるマイクロ流体レオロジープラットフォーム。 iScience 13、214–228 (2019)。

記事 Google Scholar

Haandbæk, N.、Bürgel, SC、Rudolf, F.、Heer, F. & Hierlemann, A. マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーと光学イメージングを使用した単一酵母細胞の表現型の特性評価。 ACS 上院第 1 号、1020–1027 (2016)。

記事 Google Scholar

Petchakup, C.、Li, H.、Hou, HW 生物医学応用のための単一細胞インピーダンスサイトメトリーの進歩。マイクロマシンズ (バーゼル) 8、(2017)。

Tang, T. et al. 単一細胞の形状を定量化するための顕微鏡インピーダンスサイトメトリー。バイオセンス。そしてバイオ電子。 113521 (2021) https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113521。

Xu、Y.ら。細胞全体のインピーダンス測定のレビュー。バイオセンス。バイオ電子。 77、824–836 (2016)。

記事 Google Scholar

Zhao, Y. et al. 100,000 個の単一細胞からの特定の膜容量と細胞質伝導率の定量化を可能にするマイクロ流体インピーダンスサイトメトリーの開発。バイオセンス。バイオ電子。 111、138–143 (2018)。

記事 Google Scholar

スイ、J.、フォフロンカー、F.、バタチャリヤ、D.、およびジャヴァンマール、M. 微細藻類細胞の健康状態の指標としての電気インピーダンス。科学。議員 10、1–9 (2020)。

記事 Google Scholar

Zhong, J.、Li, P.、Liang, M. & Ai, Y. マイクロ流体サイトメトリーとオンデマンドソーティングを使用したラベルフリー細胞生存率アッセイと凍結保存細胞の濃縮。上級メーター。テクノロジー。 2100906 (2021) https://doi.org/10.1002/ADMT.202100906。

Tang, T. et al. 微細藻類細胞の細胞内成分の二周波インピーダンスアッセイ。ラボオンチップ (2022) https://doi.org/10.1039/D1LC00721A。

Tang, T. et al. 微細藻類細胞における細胞内成分の損失のインピーダンスベースの追跡。感知アクチュエータ B: Chem. 358、131514 (2022)。

記事 Google Scholar

Tang, T. et al. 単一粒子の位置センサーとしての FPGA 支援非並列インピーダンスサイトメトリー。 2021年第21回国際会議ソリッドステートセンサー、アクチュエーター、マイクロシステムについて。 (トランスデューサー) 727–730 (IEEE、2021)。 https://doi.org/10.1109/Transducers50396.2021.9495657。

Fernandez-de-Cossio-Diaz, J. & Mulet, R. 連続細胞培養における最大のエントロピーと集団の不均一性。 PLOS 計算生物学。 15、e1006823 (2019)。

記事 Google Scholar

Thuronii、BW et al. 拡張されたターゲット互換性と改善されたアクティビティにより、ベースエディターが継続的に進化します。ナット。バイオテクノロジー。 2019 37:9 37、1070–1079 (2019)。

Google スカラー

ゴング、L.ら。マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーを使用した、スフェロイドとマイクロキャリアの直接かつラベルフリーの細胞状態モニタリング。小17、2007500（2021）。

記事 Google Scholar

Sun, T. & Morgan, H. 単一細胞マイクロ流体インピーダンスサイトメトリー: レビュー。マイクロフルイディクスナノフルイディクス 8、423–443 (2010)。

記事 Google Scholar

Han, X.、van Berkel, C.、Gwyer, J.、Capretto, L. & Morgan, H. 単一細胞インピーダンスサイトメトリーを使用した白血球分析のためのヒト血液のマイクロ流体溶解。アナル。化学。 84、(2012)。

越智博司：ユーグレナ・グラシリスにおける無機イオンの要求と蓄積 ZJ Jpn. 社会ニュートル。食品科学 43、54–57 (1990)。

Nigon, V. & Heizmann, P. ユーグレナ・グラシリスにおける色素体発生の形態学、生化学、および遺伝学。 211–290 (1978)。 https://doi.org/10.1016/S0074-7696(08)62243-3。

Cook, JR ユーグレナ・グラシリスにおける葉緑体集団の不均衡な成長と複製。 J. Gen. Microbiol. 75、51–60 (1973)。

記事 Google Scholar

DAVIS, E. & EPSTEIN, H. オルガネラ数の段階的変動を制御するいくつかの要因。セル解像度 65、273–280 (1971)。

記事 Google Scholar

Khatiwada, B. et al. ユーグレナ・グラシリスにおける重金属耐性と蓄積における葉緑体の役割を調査する。マイクロオーグ。 8、115（2020）。

記事 Google Scholar

Yan, R.、Zhu, D.、Zhang, Z.、Zeng, Q. & Chu, J. シネココッカス属の炭素代謝とエネルギー変換。混合栄養条件下の PCC 7942: 光合成独立栄養条件との比較。Ｊ．Ａｐｐｌ．フィコル。 4、657–668 (2012)。

記事 Google Scholar

Beardall, J. & Raven, JA 高密度培養における光合成増殖の制限: CO2 供給と光。バイオ燃料とエネルギーのための藻類。 91–97 (2013) https://doi.org/10.1007/978-94-007-5479-9_5。

Gissibl, A.、Sun, A.、Care, A.、Nevalainen, H. & Sunna, A. ユーグレナグラシリスからのバイオ製品: 合成と応用。フロント。生物工学とバイオテクノロジーの博士号を取得。 7、2296–4185 (2019)。

Einicker-Lamas, M. et al. 真核細胞における Cu2+ および Zn2+ の毒性と蓄積の研究のモデルとしてのユーグレナグラシリス。環境。汚染。 120、779–786 (2002)。

記事 Google Scholar

Wang, Y.、Seppänen-Laakso, T.、Rischer, H. & Wiebe, MG さまざまな温度、光、栄養条件下でのユーグレナグラシリスの成長と細胞組成。 PLoS ONE 13、1–17 (2018)。

松本哲、乾博、宮武和人、中野裕也、村上和也。ミドリムシの栄養素と他の代表的な食品の栄養素の比較。エコ工学 21、81–86 (2009)。

Google スカラー

Guedes、AC および Malcata、FX 水産養殖における微細藻類の栄養価と使用。水産養殖 10、59–78 (2012)。

Google スカラー

マトス、A. P. 食品科学技術における微細藻類の影響。混雑する。石油化学学会。 94、1333–1350 (2017)。

記事 Google Scholar

古橋哲ほかガスクロマトグラフィー質量分析によるユーグレナ・グラシリスのワックスエステルと親油性化合物のプロファイリング：低酸素下でのワックスエステル発酵の理解に向けて。メタボロミクス 11、175–183 (2014)。

記事 Google Scholar

Sun, A.、Hasan, MT、Hobba, G.、Nevalainen, H.、Te'o, J. ユーグレナグラシリス変種の比較評価。様々な光条件下でβ-1,3-グルカンパラミロンを生産するサッカロフィラ変異株。Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ． 54、529–538 (2018)。

記事 Google Scholar

Tilman, D.、Hill, J. & Lehman, C. 低投入高多様性草原バイオマスからのカーボンネガティブバイオ燃料。サイエンス (1979) 314、1598–1600 (2006)。

Google スカラー

Kottuparambil、S.、Thankamony、RL & Agusti、S. 付加価値代謝物の潜在的な天然源としてのナス。レビュー。藻類研究 37、154–159 (2019)。

記事 Google Scholar

Barsanti, L.、Passarelli, V.、Evangelista, V.、Frassanito, AM & Gualtieri, P. 化学、物理化学、およびβ-グルカンの生物活性に関連する応用。ナット。製品。議員第 28 号、457 (2011)。

記事 Google Scholar

Spencer, D. & Morgan, H. 高速単一セル誘電分光法。 ACS Sens. 5、423–430 (2020)。

記事 Google Scholar

Salahi, A.、Honrado, C.、Rane, A.、Caselli, F. & Swami, NS 電気生理学に基づく単一細胞サイトメトリーおよび分離のベンチマーク用のマルチモーダル標準としての修飾赤血球。アナル。化学。 94、2865–2872 (2022)。

Koren、LE、ユーグレナ・グラシリス光合成用高収量培地、ZJ Portozool 14、17 (1967)。

Google スカラー

Cramer, M. & Myers, J. ミドリムシの成長と光合成の特徴。アーチ。毛皮。微生物学 17、384–402 (1952)。

記事 Google Scholar

村松哲ほかミドリムシの運動性欠損変異体の単離と特性評価。 PeerJ 8、e10002 (2020)。

記事 Google Scholar

Cousins, RJ 遺伝子発現の調節における亜鉛の役割。手順ニュートル。社会 57、307–311 (1998)。

記事 Google Scholar

Kamilanathan, M.、Chaisutyakorn, P.、Gleadow, R. & Beardall, J. 緑藻のScenedesmus sp.によるバイオマス生産における光独立栄養性、従属栄養性、および混合栄養性成長の比較。 (緑藻科)。 https://doi.org/10.2216/17-82.157、309–317 (2019)。

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タオ・タン、Xun Liu、Tianlong Zhang、喜屋良太、細川洋一郎、ヤシアル・ヤリクン

理化学研究所生命機能科学研究センター (BDR) 〒565-0871 大阪府吹田市山田丘 1-3

ヤペン・ユアン、ヨウ・タナカ、ヤシアー・ヤリクン

マッコーリー大学工学部、シドニー、2109、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア

チャン・ティエンロン & ミン・リー

中国科学院深海科学技術研究所、海南市三亜、572000、中国

ヤンヤン

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Kengo Suzuki

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ヤシアル・ヤリクンへの対応。

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転載と許可

Tang, T.、Liu, X.、Yuan, Y. 他 4 周波数インピーダンスサイトメトリーを使用した細胞膜の電気的透過の評価。 Microsyst Nanoeng 8、68 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41378-022-00405-y

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受信日: 2022 年 2 月 9 日

改訂日: 2022 年 5 月 16 日

受理日: 2022 年 5 月 30 日

公開日: 2022 年 6 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41378-022-00405-y

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