コレステロール生合成はマウス頭蓋神経堤細胞の分化を調節する

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7073 (2023) この記事を引用

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頭蓋神経堤細胞 (cNCC) は、多様な細胞型を生み出す多能性胚細胞集団です。これらの細胞は、母体の高血糖と先天奇形との関連で例示されるように、外部の代謝ストレス因子に対して特に脆弱です。我々は、確立されたマウス神経堤細胞モデル (O9-1) を使用して、cNCC の代謝、遊走、分化に対するさまざまな濃度のグルコースとピルビン酸の影響を研究することに興味がありました。我々は、予想外にも、O9-1細胞におけるグルコース枯渇条件下でのコレステロール生合成誘導を示唆する遺伝子発現パターンを観察した。さらに、2 つの異なるコレステロール合成阻害剤による治療は細胞の遊走と分化を妨げ、平滑筋細胞の分化を促進しながら軟骨形成を阻害することを示しました。 SMCHD1 の変異によって引き起こされる奇形である先天性鼻炎（外鼻の欠如）は、部分的には cNCC の欠陥を表しているようであるため、我々は、O9-1 細胞における Smchd1 発現に対するグルコースとコレステロールの利用可能性の影響を調査することにも興味を持っていました。。 Smchd1 発現は高グルコース条件下で誘導されましたが、コレステロール合成阻害剤は軟骨形成中に Smchd1 発現を減少させました。これらのデータは、cNCC 生理学におけるコレステロール生合成の新たな役割を強調し、SMCHD1 変異保有者におけるヒトの表現型の変動が、発生中のグルコースまたはコレステロール投与量に対する SMCHD1 の感受性と部分的に関連している可能性があることを実証している。

神経堤細胞 (NCC) は、多様な細胞型を生み出す外胚葉に由来する一過性の胚細胞集団です。胚の発育中、遊走する NCC は、固有の栄養素と局所的な酵素の活性化を伴う多様な環境を横断し、その遺伝的プログラミングと生理機能に影響を与える可能性があります 1。基質利用可能性の変動の影響を調べた研究では、発生の時空間的調節が部分的には代謝の変化によって引き起こされていることが示されています2。 NCC の代謝変化は、増殖、遊走、分化などの NCC 個体発生の重要なステップに一時的に関連しており、実際にこれらのステップを刺激する可能性があります 3。さらに、NCC は外部の代謝ストレス要因に対して特に脆弱であると考えられており、その代表的な例が高血糖です。妊娠糖尿病は、NCC由来の組織や器官（心血管系、骨格系、中枢神経系など）に影響を与える先天奇形のリスクが高いことと関連しており、母体の高血糖がNCCにとって非常に有毒であることが示唆されています4、5、6、7。実際、初期の in vitro 研究では、高グルコース培養条件が活性酸素種の過剰産生によりラット cNCC の増殖と遊走を阻害することが実証されました 8。ニワトリを対象とした最近の研究では、高グルコースへの曝露がcNCC9の発生におけるアポトーシスとERK媒介オートファジーを上方制御し、胚性幹細胞の神経系統への分化を抑制することがさらに示されている10。しかし、マウス胎児NCC由来の多分化能株であるO9-1細胞株を使用して、栄養素の利用可能性がNCCの生理機能にどのような影響を与えるかを判断する研究はこれまでに行われていない11。

NCC の個体発生、移動、および/または分化における欠陥は、神経基質障害と呼ばれる一連の状態を引き起こします。ボスマ・アルヒニア小眼球症候群 (BAMS) は、頭蓋 NCC12、頭蓋プラコード細胞 13 またはそれらの相互作用の主要な欠陥を反映していると思われる、非常にまれな重度の先天奇形です。 BAMS は、無音症（鼻の欠如）、目の欠損、および性腺機能低下症の臨床的 3 徴候で構成され 14、染色体の構造維持フレキシブルヒンジドメイン含有 1（SMCHD1）遺伝子の変異によって引き起こされます 15、16。しかし、多重家系における不完全な浸透度と可変の発現性の存在は、他の子宮内因子が SMCHD1 の発現または機能に影響を与える可能性があることを示唆しています。私たちは、栄養素の利用可能性がそのような要因の 1 つである可能性があると仮説を立てました。 BAMS 妊娠では妊娠糖尿病は報告されていませんが、BAMS は過小報告されている可能性が高く (過去 100 年間で報告された症例は 100 件未満 15)、妊娠糖尿病の診断ガイドラインは国ごとに異なり、時間の経過とともに厳格化されており、最近では母親の高血糖は、明らかな閾値なしに周産期リスクと直線的に関連していることが認識されています17。したがって、O9-1 モデルシステムを使用して、Smchd1 発現に対する栄養素の利用可能性の影響も調査しました。

私たちは、さまざまな代謝条件が cNCC の生理機能に影響を与えるのではないかという仮説を立てました。高グルコース (HG = 25 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、対照グルコース (CG = 5.55 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、グルコースなし (NG = 0 mM グルコース、1 mM ピルビン酸) の 4 つの培養条件の影響を研究しました。、2 × ピルビン酸でグルコースなし (NG2P = 0 mM グルコース、2 mM ピルビン酸)。細胞培養プロトコールでは増殖を最大化するために HG 条件が頻繁に利用されますが、発生中の胚の生理機能を最もよく表すために CG 条件が選択されました 18。 NG 条件は、cNCC がピルビン酸などの代替代謝基質を使用できるかどうかを判断するために選択されました。ピルビン酸は、炭素代謝における複数の経路の交差点に位置し、胚ゲノム活性化 19 および NCC 生理学における役割を実証しているため、特に興味深いものでした 3,20,21。

さまざまなグルコース条件 (HG、CG、NG、NG2P) がマウス cNCC における遺伝子発現にどのような影響を与えるかを調べるために、加重遺伝子相関ネットワーク解析 (WGCNA) を使用して RNA-Seq データを解釈しました。 WGCNA は、サンプル間の遺伝子間の相関パターンを考慮して遺伝子共発現ネットワークを構築します22。次に、階層的クラスタリングを使用して、遺伝子発現の相関性が高いモジュール、つまり遺伝子のネットワークを特定します。これらのモジュールは、他の特性 (ここではグルコース濃度) に関連付けられ、機能強化のために調べられます。目的のモジュールは、平均遺伝子重要性、モジュールメンバーシップ (モジュール内の遺伝子接続性)、形質との関係、または生物学的経路のいずれかに基づいて選択されます。対象のモジュールを選択するために、最初にモジュールのメンバーシップの強さ (接続性 > 0.6) を考慮しました。実験計画にグルコース濃度の勾配が含まれていることを考慮して、HG、CG、NG、NG2P という発現変化の直線勾配が存在する 2 つのモジュールを探索することを選択しました。異なるグルコース条件下で共発現される遺伝子の 16 モジュールが同定されました。青緑色のモジュールでは、条件全体で遺伝子発現が減少しましたが、青色のモジュールでは、条件全体で遺伝子発現が増加しました（図1A、B、補足表S1）。ターコイズモデルの過剰濃縮分析により、細胞周期とDNA修復に関連する経路が明らかになりましたが（補足図S1）、青色モジュールの分析では予想外にコレステロール生合成、スフィンゴ脂質、およびスフィンゴ糖脂質の代謝が明らかになりました（図1C、補足図S1）。グルコースおよびグルコース由来の代謝物は、コレステロール合成の原料を提供し、コレステロール生合成酵素と取り込みを調節します23。したがって、グルコース枯渇はコレステロール生合成を下方制御すると予想される。しかし、コレステロール合成の律速酵素である Hmgcr や 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA (HMG-CoA) の生成を触媒する Hmgcs1 などのコレステロール生合成経路のメンバー 24,25 は、環境下で発現増加を示しました。 HG と比較した NG および NG2P 条件 (図 1D)。コレステロール生合成の最終段階で重要な役割を果たすエモパミル結合タンパク質（Ebp）も、CG 対 HG 条件で上方制御されました（図 1D）。次に、さまざまなグルコース培養条件下で、遊離コレステロール、エステル化コレステロール、および総コレステロール（すなわち、遊離コレステロールとエステル化コレステロールの合計）レベルを直接測定しました。遊離コレステロールまたは総コレステロールには有意差は見られませんでしたが、CG、NG、および NG2P 条件と比較して HG ではエステル化コレステロールが低かった (図 2A ～ C)。

グルコースの利用可能性は cNCC トランスクリプトームに影響を与えます。 (A) モジュール遺伝子発現レベルと基質利用可能性の間のピアソン相関値。高グルコース (HG = 25 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、コントロールグルコース (CG = 5.55 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、グルコースなし (NG = 0 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、および 2 × ピルビン酸を含むグルコースなし ( NG2P = 0 mM グルコース、2 mM ピルビン酸) と調整された p 値 (括弧内) を各ビンに示します。 1 または -1 の相関は、それぞれ強い正または負の関係を示します。 (B) ヒートマップと棒プロットは、ターコイズとブルーのモジュールのスケーリングされた遺伝子発現と固有遺伝子の値を表示します。 (C) モジュールメンバーシップ > 0.6 についてフィルター処理された青色モジュール遺伝子の経路解析。 (D) コレステロール生合成に関与する遺伝子のヒートマップ。

グルコースの利用可能性は、cNCC のエステル化コレステロールレベルを調節します。 HG、CG、NG、および NG2P 条件で培養した cNCC の総コレステロール、エステル化コレステロール、遊離コレステロールレベルをタンパク質に対して正規化しました。グループごとに n = 3。値は平均値±SDとして表示されます。 *p < 0.05、**p < 0.01。

我々は、構造的に似ておらず、異なる点でコレステロール生合成経路に影響を与える2つの薬物を使用することにより、cNCC生理学におけるコレステロール生合成の重要性を調べることに着手した。ファトスタチンは、コレステロールと脂肪酸合成のマスター調節因子である SREBP-1 および -2 の活性化をブロックする小分子コレステロール合成阻害剤です 26。フルバスタチンは、コレステロール生合成の律速酵素である HMG-CoA レダクターゼを直接阻害します 27。両方の薬剤は、NCC 由来の悪性腫瘍である神経芽腫におけるコレステロール合成を阻害するためにも使用されています。 O9-1 細胞におけるファトスタチンの理想的な使用濃度を特定するために、まずコレステロール合成遺伝子の発現と細胞生存率の変化を測定しました。我々は、胚細胞で行われた以前の実験に基づいて濃度範囲 (5 ～ 25 μM) を選択しました 28。細胞密度に基づいた Incucyte 生細胞生存率アッセイにより、cNCC に対して無毒なファトスタチンとフルバスタチンの濃度を特定しました (図 3A)。ファトスタチンは、25 μM で O9-1 cNCC の生存率を大幅に低下させました。ファトスタチンは、48 時間の処理後に 10 μM および 25 μM で Srebf2、Hmgcr、Hmgcs1、Lss、および Mvd mRNA レベルを劇的に減少させました (図 3B)。これらの結果に基づいて、さらなる研究のために細胞生存率を損なうことなくコレステロール合成阻害を誘発する最小濃度として 10 μM を選択しました。ファトスタチンおよびフルバスタチンによる観察されたコレステロール生合成の抑制を検証するために、HG、CG、NG、および NG2P 条件の O9-1 細胞で Amplex Red アッセイを使用してコレステロールレベルを直接測定しました。 10 μM ファトスタチンの存在下では、総コレステロールおよびエステル化コレステロールレベルはすべてのグルコース条件で大幅に低下し、遊離コレステロールレベルは NG および NG2P 条件で低下しました (図 3C)。 10 μM フルバスタチンの存在下では、総コレステロールレベルは CG と NG2P で低くなり、エステル化コレステロールレベルは CG のみで低くなりました。フルバスタチン治療後、HG、CG、NG2P の遊離コレステロール値が減少しました。したがって、ファトスタチンは、フルバスタチンよりも総コレステロールおよびエステル化コレステロールレベルの抑制においてより強力であったが、これはおそらく、ファトスタチンがSREBP-2を遮断することにより、コレステロール生合成経路全体に影響を与える可能性があるためであると考えられる。

O9-1 cNCC におけるコレステロール合成阻害。 (A) ビヒクル (「0」) 条件と比較した、5、10、および 25 μM のファトスタチンまたはフルバスタチンの存在下で 48 時間培養した O9-1 cNCC の生存率。グループごとに n = 3。 (B) 0 (ビヒクル)、5、10、および 25 μM ファトスタチンで処理した HG 中で培養した細胞における Srebf2、Hmgcr、Hmgcs、Lss、Mvd の遺伝子発現レベルを 18S レベルに正規化しました。 (C) フルバスタチンの 10 μM ファトスタチンの非存在下 (ビヒクル) または存在下で、HG、CG、NG、および NG2P 条件で培養した cNCC のタンパク質に対して正規化された総コレステロール、エステル化コレステロール、および遊離コレステロールレベル。グループごとに n = 3。値は平均値±SDとして表示されます。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

cNCC におけるプログラムされた細胞死は、頭蓋顔面のパターン形成/形成の中心となります 29。グルコースの利用可能性、特にグルコースを介した活性酸素種の増加が cNCC のアポトーシスに影響を与えることが示されています9。さらに、研究では、ファトスタチンと HMG-CoA レダクターゼの直接阻害剤であるフルバスタチンの両方がアポトーシス効果を有することが示されています 30、31、32、33。したがって、我々は、さまざまなグルコース条件下でのアポトーシスに対するcNCCの感受性に対するコレステロール阻害剤の影響を調べることに興味を持った。予想通り、グルコースの増加によりアポトーシスが約 20 倍増加し、コレステロール合成阻害剤の非存在下では最新の時点で統計的有意性に達しました (図 4A)。コレステロール合成阻害剤の存在下でのアポトーシスの検査により、ファトスタチン処理のみがアポトーシスの増加をもたらし（フルバスタチンとビヒクル条件との間に顕著な差はなし）、その効果はグルコースとは無関係であることが明らかになった（図4B）。

グルコースを介したコレステロール代謝の調節は、cNCC プログラム細胞死において役割を果たしている可能性があります。 (A) コレステロール合成阻害の効果を調べるためにグルコース利用可能性の関数としてプロットされた HG、CG、NG、および NG2P 条件で培養された cNCC のアポトーシスは、Incucyte 生細胞 Casp3/7 アポトーシスアッセイによって測定されました。 n = 6 ウェル/条件; 3D 用にウェルごとに複数の画像が収集されました。 (B)、10 μM ファトスタチンまたはフルバスタチンの非存在下 (ビヒクル) または存在下で HG、CG、NG、および NG2P 条件で培養した cNCC のアポトーシスを、Incucyte 生細胞 Casp3/7 アポトーシスアッセイによって測定しました。各バーは平均値 ± SD を表します。 ****p < 0.0001。

神経管からの遊走はcNCC個体発生の重要な部分であるため、我々はコレステロール合成の遮断がcNCC遊走に影響を与えるかどうかを調べた(図5A、B)。遊走は、細胞単層に傷が導入される前に細胞が完全にコンフルエントに達するまで許容され、結果として生じる空間への細胞分極と遊走を誘導する従来の引っ掻き傷アッセイによって測定されました（補足図S2）。創傷幅は、CG および NG 条件においてファトスタチンの存在下で有意に大きく、これは遊走能力の低下と一致しています。フルバスタチン治療はまた、CG および NG においてビヒクル治療と比較して創傷幅の増加をもたらしました。ただし、この効果は CG 条件でのみ統計的有意性を達成しました。グルコース濃度単独では、O9-1 cNCC の遊走に影響を与えませんでした (図 5B)。

コレステロール生合成は、cNCC の遊走に役割を果たします。 (A) 10 μM ファトスタチンまたはフルバスタチンの非存在下 (ビヒクル) または存在下で HG、CG、NG、および NG2P 条件で培養した cNCC の細胞遊走を、Incucyte 生細胞アナライザーでスクラッチワウンドアッセイを介して調べました。グループごとに n = 4。 1 ウェルあたり複数の画像を 1 時間ごとに 36 時間収集しました。パネル (B) は、グルコース利用可能性の影響を強調するために、コレステロール合成阻害剤の非存在下での同じデータを示しています。各データ点は平均値 ± SD を表します。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

cNCC は、発達中に脳ニューロン、グリア、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの多くの細胞型を生じさせる多能性幹細胞です 30、34、35。さらに、コレステロール合成経路遺伝子の変異は、WNT シグナル伝達を介した軟骨細胞分化の異常な調節に起因する顔面異形症と関連しているとされています 43,44。

コレステロールレベルが cNCC の軟骨細胞への分化能に影響を与えるかどうかを評価するために、超生理学的 (高血糖に類似) と生理学的 (正常血糖) を比較することに特に興味があったため、HG および CG 条件下で O9-1 細胞を用いて軟骨形成アッセイを実施しました。条件を示します (図 6)。前述のように、O9-1 細胞を骨形成分化培地で 3 日間培養した後、軟骨形成分化培地で 7 日間培養しました 35。 10 日間の分化プロセス全体を通して 10 μM コレステロール合成阻害剤で処理すると、異なるグルコース条件にわたって異なる細胞コンフルエントが得られました。したがって、すべての分化実験は 5 μM ファトスタチンおよびフルバスタチンの存在下で実施されました。軟骨に存在する酸性多糖類を特異的に染色するために使用されるアルシアンブルーの定量では、ファトスタチンが HG 条件と CG 条件の両方で軟骨細胞への分化を有意に減少させるのに対し、フルバスタチンは CG 条件での分化を減少させることが示されました (図 6B)。総コレステロールレベル（軟骨形成の終わりに測定）も同様の傾向を反映していた。ビヒクルと比較して、HG および CG 条件下でのファトスタチン治療によりコレステロールが減少したが、フルバスタチン治療では CG 条件下でのみコレステロールが減少し、これはコレステロールの役割と一致している。軟骨形成におけるコレステロール (図 6C)。

コレステロール合成の低下により、cNCC の最終運命が軟骨形成から遠ざかります。 (A) ビヒクルまたは 5 μM ファトスタチンおよびフルバスタチンの存在下、HG および CG 条件で軟骨形成培地で培養した cNCC のアルシアンブルー染色。スケールバーは 50 μM です。 (B) パネル A 画像の分光光度定量化 (4cm2 サンプルウェル、グループあたり n = 5)。 (C) 指定された条件下で軟骨形成培地で培養された cNCC のタンパク質に対して正規化された総コレステロールレベル (グループあたり n = 3)。各バーは平均値 ± SD を表します。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。

また、5μMのファトスタチンおよびフルバスタチンの非存在下または存在下でHGおよびCG条件下で培養したO9-1細胞において、cNCCが平滑筋細胞に分化する能力を調べた(図7A)。平滑筋アクチン免疫蛍光の定量化により、ファトスタチンまたはフルバスタチンによる処理によるコレステロール合成の遮断により、HGおよびCG条件の両方で平滑筋細胞への分化が有意に増加することが示されました（図7B）。

コレステロール合成阻害は平滑筋の最終運命に有利に働きます。 (A) ビヒクル、ファトスタチン、およびフルバスタチン (5 μM) の存在下、HG および CG 条件で培養した cNCC の平滑筋アクチン免疫染色。スケールバーは 50 μM です。 (B) パネル A に示す平滑筋アクチンで染色した cNCC の蛍光強度密度/面積の定量化。グループあたり n = 5 フレーム。各バーは平均値 ± SD を表します。 ***p < 0.001、****p < 0.0001。

SMCHD1に注意を戻し、軟骨形成中のグルコース濃度単独およびコレステロール合成阻害がSmchd1発現に影響を与えるかどうかを調べた（図8A）。ファトスタチンによる治療は、CG および HG 条件の両方で Smchd1 mRNA 発現を減少させましたが、フルバスタチンによる治療は CG 条件においてのみ Smchd1 発現に影響を与えました。軟骨形成中のグルコース濃度はSmchd1発現に影響を与えなかった(図8A)。しかしながら、ベースラインでは、O9-1細胞におけるSmchd1 mRNA発現は、CG、NG、およびNG2P条件と比較してHGにおいて有意に増加した(図8B)。

高グルコースレベルは、cNCC における Smchd1 発現を増加させます。 (A)、特定の条件下で軟骨形成培地で培養した cNCC における Smchd1 遺伝子発現レベルを β-アクチンレベルに正規化しました (グループあたり n = 3)。 (B)、HG、CG、NG、および NG2P で培養した cNCC における Smchd1 正規化遺伝子発現レベル (RNA-seq 研究から得た) (グループあたり n = 3)。各バーは平均値 ± SD を表します。 *p < 0.05、**p < 0.01。

NCC は、脊椎動物に特有の初期胚の多分化能前駆細胞の集団です 38。それらは胚の外胚葉から発生し、剥離して体中を移動する際に上皮から間葉への移行を経て 39、頭蓋顔面の軟骨および骨、平滑筋、メラノサイト、筋線維芽細胞、末梢組織、骨、およびこれらに限定されない、さまざまな構造に寄与します。腸ニューロン、およびグリア細胞40。 NCC の広範な遊走能力と多分化能は、代謝の再配線と結びついており、それに依存している可能性があります。この再配線は、これらの細胞の固有のエネルギー要求を満たすのに役立つだけでなく、遺伝子転写を調節し、それによって分化に影響を与える代謝産物も提供する可能性があります。このプロセスにおける解糖の中心的な役割を指摘した先行研究3、8、9、10、20、41、42、43、44に基づいて、我々は、グルコース利用可能性の摂動がcNCCの生理機能にどのように影響するかを解明することに着手した。私たちの RNA-seq WGCNA とコレステロールのデータは、妊娠糖尿病などのグルコース上昇条件下では、コレステロールのエステル化が抑制されることを示唆しています。

我々は、cNCC 機能の中心となるプロセスにおけるコレステロール合成の生物学的関連性をさらに調査しました。我々は、細胞生存率を損なうことなく、コレステロール生合成の薬理学的阻害を介して、コレステロール生合成遺伝子とコレステロールの細胞レベルの大幅なダウンレギュレーションを達成しました。ファトスタチン (CG および NG 条件) とフルバスタチン (CG および NG 条件の傾向) の両方で細胞遊走の減少 (創傷幅の増加) が観察されました。興味深いことに、2×ピルビン酸を補充した場合、グルコース枯渇条件下で培養したO9-1細胞の遊走は、コレステロール合成阻害によって有意に変化しなかった。適切なNCC遊走には高い解糖フラックスが必要であることが以前に示されているが45、我々の結果はまた、ピルビン酸塩とcNCC遊走のコレステロール媒介調節との相互作用を示唆しており、更なる研究が必要である。最後に、ファトスタチン (CG および HG 条件) およびフルバスタチン (CG 条件のみ) の存在下では、cNCC の軟骨細胞への分化能力の低下と平滑筋細胞の形成への移行が観察されました。コレステロール生合成の破壊は、cNCC の増殖と生存に重要な役割を果たす Sonic-Hedgehog シグナル伝達の欠陥をもたらします 46,47。さらに、コレステロールに富む脂質ラフトは、胚発生中の細胞増殖と細胞運命の決定に関与する標準的な Wnt シグナル伝達を調節することが知られています 48。実際、カストロらは、らは、ゼブラフィッシュのコレステロール合成阻害により顔面欠損が生じ、これが Wnt アゴニストによって回復できることを示しました 37。 Wnt シグナル伝達は、軟骨形成 49 と平滑筋発達 50 の両方において重要です。したがって、Wntシグナル伝達の変化が軟骨細胞を犠牲にして平滑筋運命への分化を促進する可能性がある。総合すると、我々の結果は以前の研究 36,37 を補完し、細胞内コレステロールが cNCC の運命を決定するのに役立つ重要な内因性シグナルである可能性があるというさらなる証拠を提供します 51。

ヒト NCC でコレステロール生合成が可能であることを証明する研究はこれまでにありませんが、NCC 由来の悪性腫瘍である悪性度の高いマウスおよびヒト神経芽腫細胞の転写プロファイリングでは、転写因子ステロール調節要素によってコレステロール生合成が増加することが証明されています。結合タンパク質-2 (SREBP-2)26。脂肪滴は、E8.5 ～ 9.5 マウス胚の移動中および移動後の体幹 NCC でも確認されており 52、コレステロール貯蔵庫の可能性を示しています。さらに、スミス・レムリ・オピッツ症候群は、7-デヒドロコレステロール還元酵素の欠損によって引き起こされる稀なヒトの状態であり、頭部（例、小頭症）、顔（例、口蓋裂）、および四肢（例、、多指症または合指症）のほか、NCC 機能の障害を部分的に反映している可能性のある心臓および腸（神経節狭窄）の欠損も含まれます。最後に、コレステロール生合成経路における重要な酵素である変異体HMGCSおよびHMGCRを保有するゼブラフィッシュを用いた以前の研究では、NCC分化不全による頭蓋軟骨の奇形が同定されており 36,54 、これはO9-1 cNCCの軟骨形成中にコレステロール阻害剤を使用した我々のデータと一致している。

我々のアルヒニアコホートにおける表現型の多様性と、子宮内で作用する潜在的な環境修飾因子に対する我々の関心を考慮して、我々は、軟骨形成中のSmchd1発現に対するグルコースとコレステロールの利用可能性の影響にも興味を持った。我々は、ファトスタチン (HG および CG) およびフルバスタチン (CG) の存在下では、Smchd1 mRNA 発現がグルコースレベルが高くなると増加し、軟骨形成の完了時には低下することを観察しました。したがって、Smchd1 の発現は、グルコースの利用可能性と細胞のコレステロール含量 (軟骨形成中) の両方に敏感であると考えられます。ヒト SMCHD1 ミスセンス変異が実際に機能獲得型で作用する場合 16、高グルコースによる Smchd1 発現の増加は表現型を悪化させる可能性が考えられますが、軟骨形成中の発現低下はより穏やかな表現型 (例、鼻形成不全) を引き起こす可能性があります。または無嗅覚症）。女性が妊娠中に知らず知らずのうちに天然および真菌由来のスタチンに曝露される可能性も考えられます。スタチンは先天性欠損症と決定的に関連しているわけではありませんが 55,56、子宮内でのスタチン曝露は既存の SMCHD1 変異の表現型の影響を変化させる可能性があり、SMCDH1 媒介の抑制活性の低下と SMCHD1 変異保有者間のヒト表現型のばらつきに寄与する可能性があります 15。

全体として、我々の研究は、cNCCの生理機能と機能の「門番」として機能し、細胞の増殖、遊走、分化に影響を与える代謝シグナルを提供する、コレステロール生成の新規なグルコース媒介調節が重要な役割を果たしていることを実証している。コレステロールは、マウス cNCC 細胞の遊走と軟骨形成または筋形成系統への分化において重要な役割を果たします。この重要な調節プロセスは、妊娠糖尿病で観察されるような超生理学的グルコース濃度によって抑制されます。また、エピジェネティックなリプレッサーである Smchd1 の発現が、グルコース (O9-1 培地中) および軟骨形成中のコレステロール量に感受性があることも実証し、コレステロール、cNCC の生理機能、および頭蓋顔面発達の間の関連性がさらに確認されました。グルコース利用可能性が変化する条件下でのコレステロールを介したcNCC挙動の制御のメカニズムの基礎を明らかにするには、コレステロールの上方制御がこれらの細胞表現型を救済できるかどうかを含むさらなる研究が必要である。

O9-1 細胞は K. Shpargel (UNC-Chapel Hill) から寄贈されました。細胞を、25 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF、R&D Systems) および 1000 U/mL 白血病阻害剤を添加したマウス胎児線維芽細胞 (MEF) 馴化基本培地中、37 °C、5% CO2 でマトリゲルでコーティングしたウェル上で増殖させました。前述の因子（LIF、Millipore）3． RNAseq およびコレステロール分析では、細胞を 10 ～ 15,000 細胞/cm2 で播種し、コンフルエント > 80% に達してから 48 時間後に回収しました。

qPCR および RNAseq 用の RNA サンプルは、さまざまな基質条件で増殖させた O9-1 細胞の 3 つの培養物から抽出し、RNeasy Mini Kit (QIAGEN) を使用して精製しました。 RNA 濃度は、Qubit™ RNA HS Assay Kit および蛍光光度計 (Invitrogen) を使用して測定しました。

ライブラリは、TruSeq RNA Library Prep Kit v2 (Illumina、RS-122–2001) を製造者の指示に従って使用して生成しました。精製されたライブラリは、Agilent High Sensitivity DNA Kit を備えた Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer で定量されました。ライブラリーは Illumina NovaSeq 6000 プラットフォームで配列決定され、150 塩基対のシングルエンドリードが生成されました。 FastQC ソフトウェア 57 を使用してシーケンスの品質を評価し、phred-quality スコアが 20 未満のリードは破棄されました。残りの高品質リードは、STAR アライナー 58 を使用してマウス (mm10) 参照ゲノムにアラインメントされました。 Subread パッケージの featuresCounts ユーティリティを使用して、Gencode v.32 マウス遺伝子に一致するリードを定量化し、DeSeq259,60 を使用して発現差分析を実行しました。 log2 倍率変化 > 1 およびボンフェローニ調整 p < 0.05 の遺伝子は、差次的に発現するとみなされました。

正規化された発現値は、DeSeq2 比率中央値法 60 を使用して取得されました。重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析 (WGCNA) に有益な遺伝子は、高い変動性に基づいて、サンプルの半分で正規化された発現値が 5 以上であるように選択されました。 WGCNA は、パラメータ: ソフトしきい値 = 22、networkType = "signed"、TomType = "signed"、deepSplit = 2、minClusterSize = 30、cutTreeDynamic = 0.2522 を指定して blockwiseModule ユーティリティを使用して実行されました。類似性のしきい値が 0.25 を超えるモジュールがマージされました。割り当てられたモジュールのモジュールメンバーシップ > 0.6 を持つ遺伝子が、R gProfileR ソフトウェアパッケージ 61 を使用したパスウェイ分析用に選択されました。

R ソフトウェア (v 4.1.2) WGCNA パッケージ (v 1.71; https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-559?ref=https://githubhelp.com )22 が使用されました。特定のモジュールの遺伝子発現行列の第 1 主成分であり、そのモジュールの遺伝子発現パターンを表すモジュール固有遺伝子値とグルコース基質の間の相関関係を図 1 に示します。 . モジュール固有遺伝子値と基質利用可能性の間のピアソン相関値。高グルコース (HG = 25 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、コントロールグルコース (CG = 5.55 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、グルコースなし (NG = 0 mM グルコース、1 mM ピルビン酸)、および 2 × ピルビン酸を含むグルコースなし ( NG2P = 0 mM グルコース、2 mM ピルビン酸) と調整された p 値 (括弧内) を各ビンに示します。 1 または -1 の相関は、それぞれ強い正または負の関係を示します。たとえば、青色のモジュールの正の相関は、基質が HG から NG2P 実験条件に変化するにつれて、そのモジュール内の遺伝子の遺伝子発現が増加したことを示しています。逆に、ターコイズモジュールに割り当てられた遺伝子は、基質が HG 条件から NG2P 条件に変化するにつれて発現が減少しました。

脂質は、製造業者の指示に従って脂質抽出キット(Abcam)を使用して抽出した。簡単に説明すると、凍結細胞ペレットを抽出バッファーで処理し、10,000 × g で 5 分間遠心分離し、上清を清潔なチューブに移し、37 °C で一晩乾燥させました。抽出物を 50 μL の再懸濁バッファーに再懸濁しました。総コレステロールレベルは、Amplex Red Cholesterol Assay kit (Invitrogen) を製造元の仕様書に従って使用して測定しました。サンプルの蛍光は、550 nm での励起と 590 nm での発光検出によって測定されました。コレステロールレベルはタンパク質レベルに対して正規化し、結果はHGビヒクル条件におけるコレステロールレベルのパーセンテージとして表されました。

リアルタイムの自動化された Incucyte 生細胞 Casp3/7 アポトーシスアッセイ 62 は、コンフルエントが約 30% になった培養物に対して実行されました。アッセイは、Incucyte Caspase-3/7 色素による直接処理、タイムラプスイメージング (3 日間 2 時間ごと) によるモニタリング、および Incucyte Cell-by を使用したアポトーシス定量化を介して、Incucyte 生細胞分析システム (Sartorius) を使用して実施されました。 -Cell Analysis Software Module63 (Essen Bioscience)。cNCC 遊走は、Incucyte Scratch Wound Assay64 を使用して検査されました。簡単に説明すると、O9-1 細胞をマトリゲルでコーティングした Incucyte Imagelock プレートに播種し、細胞単層が 100% コンフルエンスに達するまで適切な培地で培養しました。 Woundmaker ツールを使用して創傷を作成し、細胞単層に正確で均一な無細胞ゾーンを作成しました。ウェルを 36 時間、1 時間ごとに画像化し、Incucyte Scratch Wound Analysis Software module64 (Essen Bioscience) を使用して細胞遊走を定量化しました。

O9-1 細胞を、基本培地のマトリゲルでコーティングされたウェルに播種しました。単層培養物を最初に骨形成培地（α-MEM、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.1 μM デキサメタゾン、10 mM β-グリセロリン酸、50 μg/mL アスコルビン酸、および 100 ng/mL）で処理しました。 mL BMP2 (ベンダー) を 3 日間培養し、3 日後、細胞を軟骨形成培地 (α-MEM、5% ウシ胎児血清 (FBS)、1% ITS (ベンダー)、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL) に切り替えました。ストレプトマイシン、10 ng/mL TGF-β3 (ベンダー)、50 μg/mL アスコルビン酸、10 ng/mL BMP2 (ベンダー)、0.1 μM デキサメタゾン、および 1 mM ピルビン酸ナトリウム) を加え、7 日間培養しました。

軟骨形成分化は、アルシアンブルー染色によって評価されました65。培地を除去し、細胞をDPBSで2回洗浄した。次いで、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で室温で10分間固定した。細胞を洗浄し、アルシアンブルー溶液 (Millipore) 中で 30 分間インキュベートしました。核をNuclear Fast Red溶液(Abcam)で染色した。アルシアンブルー染色は、4cm2/サンプルウェル内の細胞を620nmで分光測光定量することにより測定した。

O9-1 細胞を、基本培地のマトリゲルでコーティングされたウェルに播種しました。単層培養物を平滑筋分化培地（DMEM、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシン）中で 7 日間維持し、下流の実験のために固定しました。

平滑筋の分化を検出するために、細胞を 4% パラホルムアルデヒド中で室温で 10 分間固定し、続いて 0.4% Triton X-100/DPBS で 10 分間透過処理しました。細胞を10% BSA/0.1% Tween 20でブロックし、平滑筋アクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology）および蛍光標識二次抗体（Invitrogen）とともにインキュベートしました。核はHoechst 33,342で染色されました。

O9-1細胞を、PBS pH 7.4中の4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定した。細胞をＰＢＳ０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で１０分間透過処理した。細胞を10% BSA PBS、0.1% Tween 20でブロックしました。細胞を3% BSA PBS、0.1% Tween 20中で平滑筋アクチン抗体（Santa Cruz Biotechnology）とともにインキュベートしました。細胞を3% BSA PBS、0.1% Tween 20中で蛍光標識二次抗体（Invitrogen）とともにインキュベートしました。 BSA PBS 0.1% Tween 20。核はヘキストで染色しました。

全RNAをiScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を用いて逆転写した。リアルタイム定量的 PCR は、CFX96 リアルタイムシステムと sso Advanced universal SYBR green super mix (Bio-Rad) を使用して実行されました。 β-アクチン発現を使用して、各サンプルの目的の遺伝子を正規化しました。リアルタイム定量的 PCR は、オリゴヌクレオチドプライマー β-actin F 5-CGCATCCTCTTCCTCCCTGG-3'、β-actin R 5-GTGGTACCACCAGACAGCAC-3'、Hmgcs F 5-TGATCCCCTTTGGTGGCTGA-3' を使用して設定しました。 Hmgcs R 5'-AGGGCAACGATTCCCACATC-3'、Hmgcr F 5-ATCCTGACGATAACGCGGTG-3'; Hmgcr R 5'-AAGAGGCCAGCAATACCCAG-3'、18S F 5-AAACGGCTACCACATCCAAG-3'; 18S R 5'-CGCTCCCAAGATCCAACTAC-3'、Lss F 5-GGCTGGTGATTATGGTGGT-3'; Lss R 5'-CTCGATGTGCAAGCCCCA-3'、Mvd F 5-ATGGCCTCAGAAAAGCCTCAG-3'; Mvd R 5'-TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT-3'、Smchd1 F 5'-GATGGCCTTGACAGCTCAAAC-3、Smchd1 5'-CGCCAAGTAAAACACAGATCCTT-3'、Srebf2 F 5-GACCGCTCTCGAATCCTCTTATGTG-3'; Srebf2 R 5'-GTTTGTAGGTTGGCAGCAGCA-3'。倍数変化は、2-ΔΔCtを計算することによって得られた。

データは、Prism 9 (GraphPad Software) を使用して分析されました。統計的有意性は、多重比較についてはダネット検定を使用した一元配置分散分析、および多重比較についてはテューキー検定を使用した二元配置分散分析によって決定されました。すべての実験は少なくとも 3 回実行されました。データは平均値 ± SD として表示され、有意水準は p < 0.05 に設定されました。

この記事の結論を裏付けるデータセットは、Sequence Read Archive (SRA) リポジトリ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)、アクセッション番号: PRJNA883392 で入手できます。

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この研究は、NIH、国立環境保健科学研究所 [NIEHS] の学内研究プログラム (NDS に対する 1ZIAES103327-03 および MBF に対する Z01 ES102005) によって部分的に支援されました。 NDS は、Lasker Clinical Research Scholar (1SI2ES025429–01) としてもサポートされています。内容は著者のみの責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

国立衛生研究所 (NIH) によって提供されるオープンアクセス資金。この研究は、国立衛生研究所、国立環境保健科学研究所の学内研究プログラム (1Z1AES103327-05 および Z01 ES102005) によって部分的に支援されました。 NDS は、Lasker Clinical Research Scholar (1SI2ES025429-01) としてもサポートされています。

これらの著者、Florencia Pascual と Mert Icyuz も同様に貢献しました。

国立環境健康科学研究所臨床研究部門、111 TW Alexander Drive, MD D3-02、リサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ州、27709、米国

フローレンスイースター、マートアイキュズ、エリザベスヴァンゴーダー、ナタリー D. ショー

免疫、炎症、疾患研究所、国立環境健康科学研究所、111 TW Alexander Drive、リサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ州、米国

ピア・カルマウス & マイケル・B・フェスラー

Biostatistics and Computational Biology Branch、National Institute of Environmental Health Sciences、111 TW Alexander Drive、Research Triangle Park、NC、USA

アシュリー・ブルックス

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FP: 構想、実験の計画と実施、データ収集、データの分析と解釈、論文の執筆、MI: 実験の計画と実施、データ収集、データの分析と解釈、論文の執筆、PK: データの分析と解釈、編集論文、AB: データの分析と解釈、論文の編集、EV: 実験の実行、MBF: 構想、論文の編集、NDS: 構想、実験の監督、データの分析と解釈、論文の執筆と編集。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ナタリー・D・ショーへの通信。

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転載と許可

Pascual、F.、Icyuz、M.、Karmaus、P. 他。コレステロール生合成は、マウスの脳神経堤細胞の分化を調節します。 Sci Rep 13、7073 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-32922-9

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受信日: 2023 年 1 月 5 日

受理日: 2023 年 4 月 4 日

公開日: 2023 年 5 月 1 日

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