「バイセル」における膜タンパク質の結晶化の仕組み - 石家荘市イルラーゴデイチーニ有限公司

Scientific Reports volume 12、記事番号: 11109 (2022) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

主にLCPと「バイセル」結晶化の開発による目覚ましい進歩にもかかわらず、構造情報の欠如が膜タンパク質（MP）研究のボトルネックのままです。主な理由は、結晶化のメカニズムが完全に理解されていないことです。今回我々は、MP結晶成長の過程における「バイセル」結晶化マトリックスの進化に関する小角散乱研究を紹介する。初期状態では、マトリックスは液体状のバイセル状態に相当します。しかし、沈殿剤を添加すると、結晶化マトリックスはゼリー状の状態に変化します。データは、この最終相が相互接続されたリボン状二重層で構成され、そこで結晶が成長することを示唆しています。少量の多層相が現れ、その体積は成長する結晶の体積と同時に増加します。ラメラ相は結晶を取り囲んでおり、結晶成長にとって重要であり、これは LCP 結晶化にも一般的であると考えられます。この研究は、「バイセル」MP 結晶化のメカニズムを明らかにし、結晶化の合理的な設計をサポートします。

膜タンパク質 (MP) は、膜を通過するイオン輸送、エネルギー変換、シグナル伝達などの生細胞のプロセスにおいて重要な役割を果たしています 1,2。ヒトゲノムの 3 分の 1 は膜タンパク質をコードしています。膜タンパク質は人間の生理学において重要な役割を果たしているため、現在使用されている薬剤の約 60% の標的となっています 3,4。現在まで、高解像度のタンパク質構造を取得するために最も広く使用されている方法は X 線結晶構造解析であり、これには高品質のタンパク質結晶が必要です。しかし、膜タンパク質の結晶化は依然として大きな課題です。膜タンパク質のユニークな構造 5 は、利用可能なすべてのユニークな高解像度タンパク質構造のわずか 1% 程度しか占めていません 6。インメソ法の 1 つは、バイセル混合物中での結晶化です7、8、9、10、11。それにもかかわらず、この方法はいくつかの重要な MP の解明につながりますが、そのメカニズムはまだ不明であり、徹底的な試行錯誤にのみ依存しています。「バイセルからの結晶化」という用語は、マトリックスの初期状態にのみ関係している可能性があり、ビセル状態から結晶成長をサポートできるマトリックスへの進化は解明されていません。

これらの障害を克服するのに役立つ新しい方法、材料、ツールを開発するために多大な努力が払われてきました。しかし、これまでの試みにもかかわらず、膜タンパク質構造の堆積速度（最初の膜タンパク質構造は 1985 年に堆積）は、可溶性タンパク質で達成された速度にはまだ程遠いです。

この課題を克服するために、新しい方法、すなわち脂質立方相 (LCP) マトリックス中での MP 結晶化が 1996 年に導入されました 12。このアプローチにより、困難な MP (ロドプシン 13、14、15 および G タンパク質共役受容体など) の結晶化が可能になりました。標準的な蒸気拡散法による結晶化に何十年も耐えてきた16、17、18。

インメソ結晶化アプローチは、LCP マトリックスを作成するためのさまざまな特性を持つ脂質の利用 19、MSP ベース 20 またはポリマー境界ナノディスク 21,22 からの結晶化、バイセル 7,9 からの結晶化など、他の方法やツールでさらに開発および拡張されました。、10．

以前に、バイセルは、ミセルよりも優れている可能性がある膜模倣モデルとして紹介されました 23。脂質と界面活性剤の一部の混合物は、脂質二重層、コア、および界面活性剤で安定化されたリムを備えた円盤状粒子を形成し、天然の細胞膜を模倣することによって MP に安定化環境を提供することが示されました。ジミリストイルホスファチジルコリン (DMPC) は、バイセルの長鎖リン脂質成分としてよく使用され、同様の鎖長で異なる頭部基を持つリン脂質をドープできます。一方、リムは、3-(コールアミドプロピル) ジメチルアンモニオ-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート (CHAPSO) などの胆汁酸塩の短鎖誘導体によって安定化できます。バイセルの長鎖リン脂質は、短鎖リン脂質や界面活性剤を含まない平面コア領域に隔離されているため、バイセルのコア領域は、従来の界面活性剤ミセルよりもはるかによく天然膜の一部を模倣します。これらの脂質粒子のサイズと特性は、長鎖脂質と界面活性剤または短鎖脂質の比 (Q 比) および脂質濃度の関数として変化します。 Q のバリエーションにより、さまざまな種類の生物学的研究に適したさまざまな同様のバイセル相が提供されます。一般に、高い脂質比 (Q > 2) と広い濃度範囲 (Clp = 0.25 ～ 25% (w/w)) では、直径約 100 ～ 500 Å のバイセルが形成されます 24,25,26,27 、28、29、30、31、32、33。 Q が減少すると、バイセルが小さくなります 24、34、35、36。

バイセル混合物は、脂質と界面活性剤（または短鎖脂質）の比（Q）、脂質濃度（Clp）、温度（T）、および化学組成に応じて構造可塑性を示します24,25,28,29,31,37,38 、39、40、41、42、43、44、45。

2002 年に、S. Faham と JU Bowie は、ビセル形成脂質/界面活性剤系に基づいて膜タンパク質を結晶化する新しい方法を初めて発表しました7。このアプローチで得られたバクテリオロドプシン (BR) 結晶は、単位格子寸法 a = 45.0 Å、b = 108.9 Å、c = 55.9 Å、β = 113.58°、および二量体非対称単位を持つ空間群 P21 に属し、高域まで回折しました。解決。ＢＲの結晶は、ＬＣＰアプローチによって成長させたすべての結晶の場合と同様に、タンパク質の典型的な膜状のサンドイッチパッキングを有するタイプ１であると考えられる。それ以来、いくつかの重要な膜タンパク質がこのアプローチによって結晶化されてきました7,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63 、64、65、66、67、68、69、70、71、72 (表 1 およびその拡張バージョンの表 S1 を参照)。

支配的なパラダイムに反して、我々の文献データの分析は、「バイセル」アプローチで成長させた結晶で得られた公表された構造が両方のタイプであることを示しています（メソ結晶化に典型的なタイプI結晶だけではありません）。水溶性ドメインを持たない内在性タンパク質は通常層状の I 型結晶を形成しますが、比較的大きな (50 Å 以上) 水溶性領域を持つタンパク質は II 型結晶を形成する傾向があります。ただし、結晶化条件によっては、後者の場合でもタイプ I 結晶が形成される可能性があります (表 S1 を参照)。特に、結晶型が沈殿剤溶液の組成に依存することはありません。これは、初期のバイセル状態から成長する膜タンパク質結晶が、結晶化マトリックスの構造状態の主に異なる経路を経て、主に異なる 2 種類の結晶が生じる可能性があることを意味している可能性があります。この研究の主な焦点は、タイプ I 結晶の成長です。

バイセル系の形態は、SAS、NMR、AFM、EM によって研究されています 25,28,29,31,37,38,39,40,41,42,43,73。結晶化に適した Q (Q = 3 付近) の場合、要約された状態図には、バイセル、分枝虫状ミセルやリボン状構造などのネマチック相、多層構造、穴あき膜などの特定の領域が含まれます (補足図 S1 を参照) (A))。脂質系の相状態は温度に依存し、タンパク質の結晶化に影響を与える可能性があることが知られています74。

興味深いことに、システムの温度依存性は複雑ですが、バイセル法で成長した結晶のほとんどは室温で得られました。一般に、低温および脂質濃度では、システムはバイセルを含む液体懸濁液になります。温度と濃度Clpが増加すると、システムは虫状およびリボン状の構造を形成します28、30、37、38、39、75、76。温度または濃度がさらに上昇すると、単層または多層構造と穴あき膜からなるゲル相への転移が引き起こされます24、28、29、37、38、39、75、77、78。この研究で使用されたものと同様の DMPC/CHAPSO システムが以前に説明されています 24。室温から 32 °C までの温度範囲では、この系はバイセル構造とリボン状構造で構成されますが、図の一部は定義されていませんでした (図 S1(B))。

公開されている状態図のほとんどは、バイセルの純粋な水性懸濁液について得られたものです。結晶化実験の場合、系に沈殿剤と MP が追加され、その形態が変化する可能性があります。バイセラー混合物の相挙動は、膜電荷と緩衝液の塩分によって影響を受けることが示されています。たとえば、高い塩分は、荷電した DMPC/DHPC/DGPC システムにおける小胞形成と凝集体の形成を促進します 79。次に、膜上の電荷の存在により、脂質二重層の穿孔が誘発される可能性があります24、30、80。

したがって、よく使用される用語「バイセルからの結晶化」は、出発結晶化マトリックスがバイセル、膜タンパク質（天然の膜または膜模倣系に囲まれている）および緩衝液からなる液相であることを意味するだけかもしれない。しかし、結晶化の開始後（沈殿剤の添加時）に結晶マトリックスに何が起こるか、また結晶が成長するときの相状態（構造）がどのようなものであるかは不明です。

今回我々は、初期のバイセルからMP結晶が成長する最終的なゼリー状状態に至るまでの結晶化マトリックスの構造進化を小角X線および中性子散乱（SAXSおよびSANS）で研究した結果を紹介する。 Q 値が低い場合、両親媒性物質はミセルを形成します 81 が、Q が増加するとバイセルを形成する傾向があります。タンパク質の結晶化には、Q = 2 ～ 3 の混合物が使用され、最も頻繁に使用される両親媒性物質は DMPC および CHAPSO (または DHPC) です (表 S1 のリストを参照)7,46,47,48,49,50,51 、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70。

膜タンパク質結晶の成長は、同じ実験で同時に監視されました。マトリックスの最終的な（ゼリー状の）状態は、結晶が成長しており、相互接続されたリボン状の二重層によって形成されました。

私たちの研究では、BR 結晶の形成が以前に観察された十分にテストされた結晶化システムと条件を使用しました 7,46。実験は以下の 4 つのステップに分けられました (図 1A): (1) 氷上での結晶化システムの準備。（２）結晶化系をガラス毛細管に装填する。（３）沈殿剤の添加および結晶化マトリックスの構造変化のリアルタイムモニタリング。（４）結晶化マトリックスにおけるバクテリオロドプシン結晶の形成のリアルタイムモニタリング。

実験ステップのシーケンス。 (A) 毛細管内のバイセルにおけるバクテリオロドプシンの結晶化の実験段階の概略図。ステップ１−氷上での結晶化系の調製（バイセルと紫膜の混合物）。ステップ２−バイセル／紫色膜混合物をキャピラリーに装填する。ステップ３−沈殿剤の添加およびその後の結晶化マトリックスの変化のモニタリング。ステップ４−ＢＲ結晶の形成のモニタリング。ステップ 2 ～ 4 では、リアルタイム SAXS を使用して結晶化システムの構造と結晶の成長のモニタリングが実行されました。 (B) - ステップ 1 (0 日目)、2 (4 日目)、3 (8 日目および 17 日目) に対応する、実験のさまざまなステップでの結晶化システムの写真 (A と垂直に並べたもの)。結晶化系は透明/半透明の均一相を示します。ステップ 4 (24、25、および 65 日目) では、小さな結晶が現れ、その後最大サイズまで成長しました。

ステップ 2 ～ 4 では、結晶化システムと結晶の成長のモニタリングが SAXS を使用して実行されました (図 2、3)。並行して、光学顕微鏡 (Olympus SZX-ILLK200) を使用してシステムを観察しました (図 1B)。

結晶化プロセス中の結晶化マトリックスの進化。 PM を含まない純粋な DMPC/CHAPSO 混合物 (左) と結晶化システム DMPC/CHAPSO/PM (右) の SAXS 曲線。 PM を使用した場合と使用しない場合の結晶化システムの実験データは、それぞれ薄紫とオレンジ色の白丸で示されています。 PM の SAXS 曲線は、濃い紫色の四角で示されています。バイセルとリボンのフォームファクターによる近似は青い線で示されています。結晶化マトリックスの構造組織のグラフ表示は、対応する SAXS 曲線の隣に示されています。

結晶化プロセスのさまざまなステップにおける結晶化系の SAXS 曲線の変換。 (A) SAXS 曲線は、結晶化プロセスのさまざまなステップに関連しています。小角度領域の赤い矢印は、脂質/界面活性剤のスメクチック相からの干渉ピークを示します (曲線の指定は凡例に示されています。ステップの番号付けは図 1 に記載されています)。 (B) ベースラインの減算によって SAXS 曲線 (パート A) から抽出されたピーク。視覚的にわかりやすくするために、曲線は縦方向に分離されるようにスケーリングされています。黒い矢印「Lα1」と「Lα2」（A、Bの両方に表示）は、1次と2次のラメラピークを示します。もう一方の黒い矢印「Lcryst 64 Å」は、タンパク質表面に結合した局所ラメラ相からのピークを示し、この Lcryst の間隔は 64 Åです。矢印「68 Å」は、Lcryst 相の前駆体を示します。

タンパク質を含む結晶化システムに加えて、タンパク質を含まない同じ条件下で同じシステムを（参考として）研究しました。データと計算は、タンパク質の存在が結晶化マトリックスの形態に影響を与えないことを示しています。私たちの系で計算された BR と DMPC の比率 (モル比 1:200、膜の断面積比 1:17、体積 1:6) は、私たちの結論を裏付けています。

結晶化系 (タンパク質/ビセル混合物) の調製は、「材料と方法」セクションに記載されている標準手順に従って氷上で実行されました。界面活性剤で可溶化したBRの代わりに紫色の膜を使用したことは注目に値します。 DMPC/CHAPSO 混合物は低濃度および低温でバイセルを形成するため、この系はバイセル構造を示すと想定されました 46。これを検証するために、すべての SAXS 実験を室温で実行しました。 SAXS 測定の間、キャピラリーは 32 °C に温度制御されたボックス内に保管されました。 DMPC/CHAPSO 混合物の初期濃度は 5.6% でしたが、これは室温でもバイセルにとって十分に低い濃度です。散乱法を使用して、適切なバッファー中の純粋なシステム（タンパク質なし）（図 2A）と、ステップ 1、ステップ 2 の結晶化システム（図 2B）の両方でバイセルの形成を観察しました。

冷却した結晶化システムをキャピラリーに移しました (「材料と方法」および図 S2 を参照)。次に、結晶化系を室温で SAXS によって研究しました。比較のために、紫膜懸濁液を別のキャピラリーにロードしました。この懸濁液には、結晶化系と同じタンパク質濃度（8.4 mg/ml）が含まれていました。両方のサンプルの散乱曲線を図 2B に示します。小角度領域 (0.04 Å-1 まで) では、曲線は結晶化系では -1.8、紫膜では -2.0 の傾きを持つ線形挙動に従います。これらの傾きは、サンプル内の大きな層状構造、この場合は紫色の膜を示しています。結晶化系の強度から紫膜の散乱強度を差し引きました。結果を図２Ｂに示す（曲線は「差強度」としてマークされている）。強度の差は、半径 50 Å、高さ 45 Å のバイセル (モデル 1) のフォームファクターによってフィッティングできます (図 2B のフィッティングと表 S2 のフィッティングパラメーターを参照)。さらに、SAXS および SANS を使用して、紫色膜の非存在下での純粋なバイセル結晶化マトリックスの構造を調べます (詳細については「材料と方法」セクションを参照)。結晶化システムは、表 S2 に記載されている同様のパラメーターを持つバイセル混合物を示し、フィッティング曲線を図 2A (SAXS 実験の場合) および図 S3 (SANS の場合) に示します。これらのシステムの SAXS および SANS データは一貫しています。バイセルからの SAXS/SANS データをフィッティングするために、「材料と方法」で説明されているコアシェル散乱長密度 (SLD) プロファイルを持つ円柱のモデル 1 を使用しました。同様のモデルは、異なる脂質/界面活性剤含有量を有するバイセルの以前の SAS 研究でも成功裏に使用されました 44,82,83,84 (テキスト文書 S2 のセクション「バイセルの SAXS プロファイル」も参照)。

平均して、コア半径は約 40 Å です。ベルトの厚さを考慮すると、合計バイセル直径は約 100 Å になります (テキストドキュメント S2 の「バイセル半径の違い」セクションを参照)。類似システム (DMPC/CHAPSO 混合物、Q = 3) の研究 24 で観察され、電子顕微鏡を使用して得られたバイセルの直径は、100 ～ 500 Å の範囲でした。 SANS モデルの適合によれば、直径は約 420 Å でした。ただし、前述の研究では、総脂質/界面活性剤濃度は 0.25 wt% でしたが、私たちの実験では 5.6 ～ 14% の範囲でした。 38 に示すように、バイセルの平均サイズは総脂質/界面活性剤濃度に大きく依存します。総脂質濃度が数倍増加すると、疑似流体力学半径は数倍減少します。したがって、私たちの研究で得られた約 100 Å というバイセルの直径は、バイセルに関する現在のデータと一致します。

ステップ 1 ～ 2 でのバイセルと PM の混合（つまり、結晶化システム）に対応するデータセットは、PM と純粋なバイセルからの散乱データの合計として説明できます（図 2B およびセクション「差のフィッティング」を参照）強度」（テキストドキュメントS2）。したがって、沈殿剤を添加する前の結晶化システムは、バイセルと紫膜の単純な混合物として説明できます。

結晶化システム (紫色膜/ビセル混合物) をキャピラリーにロードした後、結晶化システムと沈殿剤の間に空隙を設けて、同じキャピラリーの結晶化混合物の上に沈殿剤を添加しました (「実験」セクションを参照)。この瞬間から、結晶化マトリックスから沈殿剤溶液への水の拡散により、結晶化システムの体積が収縮し始めました。 1 週間後、量は 50 ～ 60% 減少し、次の週には最初の量の 40% に相当しました。その後、わずかな変化のみが観察されました。ボリューム評価の減少の図を図 S4 に示します。

ステップ 3 での SAXS 曲線の変化を図 3 に示します。曲線は大幅に変化し、結晶化マトリックスは過渡状態になりました。その後、マトリックスは安定化し、その形態は変化しませんでした。この最後の状態は、結晶化マトリックスのこの状態で結晶が成長し始めることを示すため、私たちの徹底的な研究の焦点です。

ステップ 3 の初期段階での SAXS プロファイルの重大な変化 (図 2C、D) は主に塩濃度の増加によって引き起こされることに注意することが重要です。塩濃度が増加したバッファーは電子密度が高くなります (テキストドキュメント S2 のセクション「さまざまなステップでのバッファー SLD 値」を参照)。そのため、ビセル成分のコントラスト比 Δρ = ρ – ρbuffer が塩濃度によって劇的に変化します。、SAXS 信号の変動につながります。

この段階では、ステップ 2 と同様に、結晶化系はバイセルと紫膜の単純な混合物です (図 2D およびテキストドキュメント S2 のセクション「強度の差のフィッティング」を参照) が、水の蒸発によりそれらの濃度は高くなります。結晶化系から。その間、バイセルの構造パラメータはわずかに変化します（表S2およびテキストドキュメントS2のセクション「バイセルのSLD変化」を参照）。

乾燥を続けると、系は形態変化を起こします。ステップ 3 の後半段階 (図 2E、F) の SAXS 曲線の解釈については、24 の DMPC/CHAPSO 混合物で得られた相図を参考にしました。ここで、モル比 Q = 3 は Q = に近かったです。私たちの実験では2.7でした。私たちの実験における温度と濃度条件は、図S1に示されている図上で紫色の長方形でマークされています。以前は、バイセルが細長いリボン状および虫状の凝集体に再構成されることは、さまざまな方法 (SAS、電子顕微鏡、NMR、偏光光学顕微鏡) によって検出されていました 24,38,75,85,86。 DMPC は二重層を形成する傾向があるため、これらの細長い「虫のような」物体は、DMPC 二重層の厚さに近い厚さの平らな断面 (リボン状) を持つ必要があります。したがって、リボン上の SAXS の近似には、コアシェル散乱長密度プロファイルを備えた楕円柱のモデルが使用されました (「材料と方法」、モデル 2 を参照)。楕円柱の類似モデルは、SANS データのフィッティングにすでに 24 で使用されています。ただし、前述の研究では、円柱の密度が等しいと仮定されており、SANS データに適合するには十分です。 SAXS データの場合、ミセルおよび/または二重層の疎水性部分と親水性部分のコントラストの符号 Δρ = ρ – ρbuffer が異なるため、理論的近似にはコアシェルモデルが必要です (たとえば、表 S3 を参照)。実際、リボンの合計厚さは、計算 (表 S3 を参照) と研究の両方で、DMPC 二重層の予想される厚さよりわずかに大きいことが観察されました 24。

バイセルからのリボンの形成は、DMPC の再分布とバイセルのヘッドとベルト領域の間の CHPSO 分子に関連しており、それに応じて SLD の一体化とリボンの親水性シェルの厚さが生じます。したがって、結果として得られるリボンの親水性シェルの厚さは、値 Tshell = Max (Hhead, ΔR) = ΔR = 11.4 Å に固定されます。

リボンは初期のバイセル相から始まるため、バイセルとリボンによって示される中間相の存在が予想されます。この仮定は、バイセルの相図の対応する領域と一致します（図S1Bを参照）。したがって、我々は純粋なDMPC/CHAPSO混合物(PMを含まない)中でバイセルとリボンが共存することを観察した。このシステムの散乱曲線は、リボンとリボンとバイセルの混合という 2 つのモデルで近似されます。両方のアプローチの結果を表 S3 と図 2E に示します。一般に、得られた構造パラメーターは大きく異なりません。リボンの長さ (L) はどちらの場合も約 330 Å、リボンの疎水性コアの最小半径/最大半径は、リボン/ビセル混合物の場合は 25 Å/47 Å、リボンとビセル混合物の場合は 20 Åです。リボンのみの場合は Å/43 Å (表 S3 を参照)。ただし、リボン/バイセル混合物の場合、χ2 値ははるかに低く (3.5 ではなく 1.2)、より正確な近似に相当します。

DMPC/CHAPSO混合物（PMなし）の場合のリボンの疎水性コアとバイセルの体積に従って、リボンの形成段階で、図2Eの散乱曲線が得られました。、1 つのリボンは約 10 個のバイセルから形成されます。

結晶化システム (DMPC/CHAPSO/PMs) のステップ 3 の最終段階で得られた SAXS 曲線 (図 2F を参照) には、ラメラ相 Lα、Lcryst および「位相 500 ～ 700 Å」からの回折ピークが含まれています。一般に、ここでのバックグラウンド曲線は、DMPC/CHAPSO 混合物の場合のリボンからの散乱曲線に似ています (図 2E を参照)。特に、バックグラウンドはリボンの形状因子でよく近似されており (図 2F の実線を参照)、得られた構造パラメータは「純粋な」DMPC/CHAPSO 混合物のリボンで得られたものに近似しています (表 S3 を参照)。したがって、結晶化プロセスのこの段階では、リボンが結晶化システムの主な構成要素となります。

重要なのは、この段階の散乱曲線は、扁平構造に典型的な -2.0 の傾きを持つ線形挙動をたどらないことです。これは、初期状態の PM がこの段階では存在しないことを意味している可能性があります。少なくとも、残留している PM の濃度は SAXS で検出できるほどではありません。これは、PM の大部分がバイセルからリボンへの移行と同時に解離し、BR 分子がリボンに直接組み込まれることを示しています。紫色の膜の量が DMPS/CHAPSO 混合物よりも 1 桁少ないことを考慮すると、すべての紫色の膜が溶解するはずであると想定されます。

結晶化の後の段階では、マトリックスは安定化し、SAXS 曲線はそれ以上大きな変化を示さなくなりました。この段階では、SAXS 曲線にいくつかのピークが観察されます (図 2F および 3)。起源の異なる 2 つのグループのピークがあります。 500 ～ 700 Å および Lα という名前を付けます。最初のグループは、小角度領域 q < 0.025 Å-1 に広いピークを示します (図 3A では、曲線はステップ 3.3 および 4.1 として示されています。赤い矢印はピークを示します)。これらのピークは、結晶が検出される 1 ～ 7 日前と 1 日後に観察されました。その後、結晶が成長し始めると、これらのピークは消えました。これらのピークは、70〜80 Åの他のグループのラメラピークLαを伴うか（次のサブセクションで説明します）、またはこれらのLαラメラピークが現れる直前に観察されました（図3Aのステップ3.3を参照）。

最初のピーク位置は、格子パラメータ d = 2π / qmax 500 ～ 700 Å に対応します (一連のサンプルの平均値は 660 Å)。 d = 2π / qmax ~ 350 Å に対応する 2 番目のピークは、上記の (660 Å) ピークの 2 次ピークである可能性があります。ピーク位置の比率は 1:1.79 から 1:1.89 まで変化します。または、ピークの位置の比率が 1:2 に等しくないため、これら 2 つのピークは異なる起源を持つ可能性があります。それらの外観は同期しており (「考察」セクションを参照)、格子パラメータ d ~ 350 Å はリボンの長さに非常に近い可能性があることは注目に値します。残念ながら、条件 q L ≪ 1 に対応する q 範囲のデータが入手できないため、リボンの長さを正確に推定できないため、このピークの起源について結論を出すことはできません。

小さな角度のピークは一時的なものであるため、同じサンプルを使用してその挙動を監視するのは困難でした。ピークの強度が増加し、その最大値がより小さい角度にシフトしたことを示す連続した曲線は 2 つだけです (図 4 の破線の長方形で強調表示されています)。これらのピークの考えられる性質についての議論は、「考察」セクションに記載されています。

SAXS のピークは、結晶形成前または結晶形成の瞬間に、脂質/界面活性剤の結晶化相から生じます。ピークの位置は 500 ～ 700 Å の距離に対応します (これらの値は 1 次ピークの位置から計算されました)。グラフはベースラインを差し引いた後に表示されます。観察されたピークは、出現から数日後に消失しました。各曲線は異なるキャピラリーで測定されます。視覚的にわかりやすくするために、曲線は縦方向に分離されるようにスケーリングされています。破線の長方形は、同じサンプルの 2 つの連続する曲線を強調表示しています。これらの曲線は、時間の経過とともにピーク強度が増加し、より小さな角度にシフトすることを示しています。矢印は 2 次ピークの位置を示します。

2 番目のピークグループは、格子パラメータ d = 70 ～ 80 Å のラメラ相 Lα に対応します。散乱ベクトル q の中間範囲に 2 つの層状回折ピークがあります (図 3、「Lα1」および「Lα2」として示されています)。ピークの最大位置の比率は 1:2 です。これらのピークは BR 結晶の形成前に現れ、観察期間全体 (2 か月) を通じて結晶の形成後も曲線に残りました。それらの強度は増加し、その間に最大値の位置はより大きなqにシフトしました（図3Bおよび図S5）。さらに、これらのピークは、BR 結晶が見つからなかったサンプルの曲線で観察されました。結晶化条件下でBRの非存在下で純粋な脂質マトリックスの構造挙動を研究したところ、脂質マトリックスの乾燥の最終ステップでもラメラピークがそこでも観察されることを発見しました（図2G）。これらのピークは脂質マトリックスに由来します。

最初のピーク位置 qm1 からのラメラ距離 d を d = 2π / qm1 として推定しました。まず、層状ピークが現れたとき、それらは約 84 Å の距離に相当し、その後、時間の経過とともに 73 Å の距離に相当しました。これらの値は、一連のサンプル (13 項目) について集計されました。 BR を含まない脂質マトリックスの繰り返し距離 d は 74 Å に相当します。純粋な DMPC/CHAPSO および DMPC/DHPC システムでは、温度を上昇させた場合のバイセラー混合物のラメラ相への転移が報告されています 24、25、29、31、73、87。したがって、純粋な DMPC/CHAPSO および DMPC/DHPC 混合物の報告された距離は約 62 Å および 65 Å であり 24,29、純粋な DMPC の多層小胞については約 62 Å44,88 です。私たちの実験における 73 Å という大きな値は、高濃度のバッファーと BR 分子の存在によって引き起こされた可能性があります。

二細胞混合物は、短鎖界面活性剤によって細孔が縁取られた穴あき膜を形成できるという証拠がある24、37、38、39、75、80、89、90。 SAXS では、均質な二重層と有孔二重層を区別できません。それにもかかわらず、我々は、ラメラ膜を接続し、結晶成長に必要な条件であるタンパク質が二重層から結晶成長の場所に移動するのを助けるために、推定上の穿孔が存在するはずであると仮説を立てる。この仮説を裏付ける証拠を得るためにさらなる研究が計画されています。

したがって、沈殿物の添加後、最初はバイセルと紫色膜の混合物である結晶化系は収縮し始め、バイセルと紫色膜の濃度が増加します。次にバイセルは融合してリボンになり、このプロセスには紫色の膜の溶解が伴います。また、このステップでは、500 ～ 600 Å の特徴的なパラメーターを持つ一時的な相の形成が観察されます。平均格子パラメータが 73 Å の多層相も形成されます。ステップ 4 ではこの相が残り、結晶成長が観察されます。

結晶化マトリックスが安定すると、BR 結晶が成長し始めました。毛細管充填後 2 ～ 3 週間、32 °C で保存したサンプルと 5 週間後、4 週間保存したサンプルの結晶の外観を可視顕微鏡 (「材料と方法」を参照) で観察しました。室温で保管し、その後 32 °C の温度管理されたボックスに移しました。特に、サンプルを 32 °C に移動すると、結晶の出現が加速されました。結晶成長には、結晶格子に対応する広角範囲の散乱曲線 (図 3、ステップ番号 4) に現れる回折ピークが伴いました (以下を参照)。タンパク質結晶が成長するにつれて、結晶ピークの強度は増加しました (図 S5 を参照)。これらの結晶ピークは、セクション「ステップ３」で上述したように、ラメラ相ピークＬα１、Ｌα２の存在下で常に観察された。

空間群 P21 に属し、単位胞寸法 a = 45.0 Å、b = 108.9 Å、c = 55.9 Å、β = 113.58°のバクテリオロドプシン結晶は、以前に報告された「バイセル」システムで膜タンパク質を結晶化する方法によって得られました。仕事7．私たちの結晶化実験では、同じ空間群を持つ結晶が見つかりました。結晶形成後の結晶化マトリックスの SAXS データ（対応する図 5A、B の初期データと減算データを参照）から得られたピーク位置（表 S4 を参照）を使用して、単位セル寸法を a = 43.91 Å、b として計算しました。 = 109.33 Å、c = 53.4 Å、β = 104.63°、これは以前に報告されたデータ 7 に近いことが判明しました (「材料と方法」の単位セル寸法の計算の詳細を参照)。

結晶形成後の結晶化マトリックスからの SAXS データ (BM29、ESRF)。 (A) 結晶を含む結晶化マトリックスの SAXS 曲線 (青の曲線) と対応するベースライン (赤の曲線)。 (B) ベースライン減算後の結晶化マトリックスからの SAXS 曲線 (オレンジ色)。広角ピークをよりよく観察できるように、強度に q4 を掛けます。ピークのガウス近似は黒で表されます。ミラー指数 (BR 結晶の場合) と反射数 (脂質多層 Lα または Lcryst の場合) は、対応するピークの上にマークされています (詳細については、表 S4 を参照)。

63.9 ± 0.4 Å (7 つのサンプル、21 曲線の平均値) に回折ピークがありますが、この回折ピークの位置が BR 格子間隔のパラメーターを超えているため、BR 結晶と関連付けることはできません。 2D SAXS パターンでは、このピークは点反射として表示されます (図 6A)。したがって、このピークは準結晶脂質相に起因すると考えられます。このピークは常に層状 Lα ピークの存在下で観察され、場合によっては BR 結晶が可視顕微鏡や SAXS で観察される前に観察されます。その振幅は、BR 結晶ピークの強度と同時に変化します (図 S5)。 Lcryst ピークと結晶のピークの位置は、観察時間中、誤差範囲内で変化しません。記載されているピークには「前駆体」がある可能性があります。いくつかのサンプルでは、68 Å でピークを記録することができましたが (図 3B および 6B)、数日後には 64 Å にシフトし、その位置を保持しました。６８Åの同じ位置が、可視顕微鏡法またはＳＡＸＳのいずれによってもＢＲ結晶を登録しなかったいくつかのサンプルで観察された。この場合、ピーク位置は観察期間中（60日間）変化しませんでした。これらの場合の結晶化系には、可視顕微鏡で観察されるように、未形成のタンパク質凝集体が含まれています (図 S6(A、B) を参照)。結晶形成の開始時に脂質タンパク質の核形成が存在すると仮定します。この核には、「前駆体」ピークの出現に反映される 68 Å の特徴的な間隔があります。その後、結晶は固定された格子間隔で成長し始め、観察されるピークは 68 Å から 64 Å にシフトし、結晶成長中にこの位置は変化しなくなります。我々は、64 Å のピークが BR 結晶と物理的に結合している局所的な側方脂質相に対応している可能性があることを示唆しています。これは、LCP 結晶化について説明されているラメラ系に似ています 17、91、92、93。 LCP における結晶化の場合の局所ラメラ相の直接観察が、BR93 および膜貫通ペプチド DAP12-M94 について記載されています。この局所的な脂質相は結晶に物理的に付着しているため、結晶に対して配向していることが予想されます。さらに、膜の平面は「タイプ I」結晶の平面と平行である可能性があります。この局所位相の配向は、2D 散乱画像の「前駆体」ピークが個別の回折ピークのセットによって表されていることを意味しており、これはデータで観察できます (図 6A を参照)。

局所ラメラ相 Lcryst のピークの挙動。 (A) BR 結晶を含むサンプルの 2D パターン (図 3 の 1D 曲線ステップ 4.3 に対応)。局所的なラメラ位相 Lcryst に対応する反射が白い矢印で示されています。散乱リングは、約 84 Å の間隔を持つ多層相 Lα に属します。 (B) 1D 曲線上の局所ラメラ相 Lcryst のピークの挙動。すべての SAXS 曲線は、同じサンプルの異なる時点に属します。結晶化条件は図3のサンプルと同じです。

したがって、結晶化系が平衡化した後、結晶の形成と成長が始まります。この段階では、リボンが優勢に存在し、タンパク質が格子定数 73 Å の多層相 Lα から結晶形成の中心に移動するのを助ける可能性があります。また、おそらく格子定数 64 Å の結晶表面 (Lcryst) に直接接続されていると思われるラメラ相の形成も観察されました。この段階では、タンパク質が結晶表面に拡散する可能性があります。

SAXS を使用して、DMPC/CHAPSO 混合物中のバクテリオロドプシンの結晶化中の結晶化マトリックスの構造進化を調査しました。最初は双細胞型でした。我々は、最初の段階でマトリックスがバイセルと紫色の膜の混合物を提示することを示しました。したがって、界面活性剤に可溶化されたタンパク質がLCPに添加されるLCPや小胞などの他の結晶化システムとは対照的に、最初はタンパク質はバイセルに取り込まれません。

蒸発の開始時に、SAXS 曲線は大きな変化を示します。この変化は、塩濃度の増加と、それに対応する緩衝液の電子密度の増加によって引き起こされます。ただし、DMPC と CHAPSO は依然としてバイセルに組み立てられています。

次のステップでは、沈殿剤とマトリックスからの蒸発水の存在下で、マトリックスはリボン状の構造で構成される相に変化します。この段階では散乱曲線は劇的な変化を示さず、その後結晶成長が観察されます。相は粘性があり、これはリボンの分岐と相互接続を示している可能性があります。リボンを連続ネットワークで接続すると、核形成部位へのタンパク質分子の送達と結晶成長が促進されるはずです。

リボンが整然とパッケージに並んでいることも考えられます。したがって、散乱曲線に現れる非結晶ピークは、リボン間の短距離秩序として解釈できます。したがって、リボン状の段階では、曲線の小角度領域 (q < 0.025 Å−1) で一時的なピークが観察されました。これらのピークは、2 つの秩序方向の間隔パラメーター 270 ～ 350 Å および 500 ～ 700 Å に対応します。この「500 ～ 700 Å」相が何であるかについては、2 つの解釈が可能です。最初の解釈は、これらのピークは 270 ～ 350 Å および 500 ～ 700 Å の格子パラメータに対応し、リボン状構造で構成されるコレステリック相の形成に関連付けられる可能性があるというものです。この仮定は、格子パラメータがリボンの長さよりもはるかに大きいという事実に基づいています (表 S3 を参照)。コレステリック相の観点からは、格子パラメータ 500 ～ 700 Å は、ピッチ 95 として知られるダイレクター軸に沿った回転周期 (360° の完全な回転が完了する距離) に対応します。格子パラメータが 270 ～ 350 Å の 2 番目のピークは、SAXS 曲線の近似から得られたリボンの長さに対応します (表 S3 および図 2F を参照)。これは、この仮説コレステリック内のリボンの追加の配向を示すことができます。層。 2 番目の解釈は、270 ～ 350 Å および 500 ～ 700 Å の格子パラメータを持つこれらのピークは、リボン状構造で構成されるスメクチックの形成に関連付けられる可能性があるというものです。スメクティクスは、層間と 1 つの層内の要素間の 2 つの順序パラメータによって特徴付けられます。私たちの場合、スメクチック層はリボンによって形成される可能性があります。最初のスメクティックピークは、層間の 500 ～ 700 Å の距離に対応します。 2 番目のピークは、1 層のリボン間の距離 270 ～ 350 Å に対応します。 DMPC/DHPC 混合物におけるネマチック構造と配向的に規則正しい虫状ミセルの形成は、偏光光学顕微鏡と小角中性子散乱 (SANS) を使用して示されました 28,75,89。純粋な DMPC/DHPC 混合物に関する参考文献 28 は、SANS 曲線の q ～ 0.015 Å-1 にブロードなピークが現れることを示しています。これは約 450 Å に相当し、パラメータに近い値です。また、DMPC/DHPC 混合物中での配向的に規則正しい虫様ミセルの形成は、さまざまな方法によって示されました 28、31、73、75、89、90。

これらのピーク 270 ～ 350 Å および 500 ～ 700 Å を明確に解釈することは、SANS と SAXS だけを使用することによっては不可能です。私たちは、リボン状の構造が結晶化系の主要な構成要素であることを突き止めました。ただし、リボンがどのように接続されているか、および正確にどのように相互に配向されているかは不明のままです。相の重要なデータを理解するには、追加の実験、特に補足的な電子顕微鏡研究が望ましいです。これらのピークの真の性質とは独立して、そのような規則的な構造の形成が結晶化マトリックス内でタンパク質の規則性を誘導し、タンパク質の結晶化を促進する可能性があると我々は推測しました。

次に、距離パラメーター 73 Å で多層相を観察しました。多層膜相 Lα もマトリックス内に形成されている段階で、結晶の出現と成長を SAXS と可視顕微鏡で検出しました。この証拠は、拡張されたラメラ構造の存在が結晶成長の重要な条件であることを強調しています。おそらく、この段階は、LCP 成長結晶で観察されるものと同様の結晶成長を伴います。 SAXS 曲線はリボンの形状因子による良好な近似を示すため、リボン状の構造はシステムの主要なコンポーネントであると想定されます。

結晶表面に結合した局所的なラメラ（Lcryst）相の存在が結晶成長を可能にしていると考えられます。 Lcryst の存在は、散乱曲線における回折ピークの出現によって明らかです。結晶核形成時の Lcryst の距離は 68 Å です。その後、結晶の形成と成長中に、このパラメータは 64 Å に減少し、観察の終了 (60 日) までこの値が維持されます。タンパク質はこの相を介して結晶表面に拡散する可能性があります。

したがって、既存のパラダイムとは対照的に、私たちの研究は、初期のバイセルではなく、「バイセル」結晶化マトリックスのゼリー状の状態が結晶が成長する状態であることを示しています。我々は、これらのラメラ構造は、タンパク質が二重層から結晶の成長に必要な条件である結晶形成の場所へ移動するのを助けるために相互接続されているはずであると仮定する。この仮説を裏付ける証拠を得るためにさらなる研究が計画されています。

重要なのは、結晶形成時に少量の多層相が現れ、その体積は成長する結晶の体積と数と同時に増加します。したがって、我々は、ラメラ相が結晶を取り囲み、LCP 結晶化にも共通しているように、結晶成長にとって重要であると結論付けています 17,91,92,93。

私たちの研究で述べた結晶化マトリックスの進化に関する入手可能な情報をすべて、図 7 に示すさまざまな構造要素の連続的な出現/消失のスキームに要約します。このプロセスは、次の単純な混合物を含む液相から始まります。バイセルと紫色の膜。最初は、乾燥時の結晶化マトリックスの体積の減少により、バイセルとPMの濃度が増加します（図S4を参照）。次に、バイセルが融合してリボンになります。このプロセスには PM の溶解が伴います。リボンはゲル状の相を形成します。これは、BR 結晶の出現および成長中の結晶化マトリックスの主成分です。ただし、リボンと結晶の出現の間に、さらにいくつかのタイプの構造要素が出現します。ラメラ脂質相 Lα、「500 ～ 700 Å の相」、および局所ラメラ相 Lcryst です。 Lαは、リボンの融合により出現する多層脂質膜に相当します。 Lαの量は、リボン濃度のゆっくりとした減少と同時に増加します（図S5Aを参照）。結晶が成長するよりもはるかに長い時間（約 100 日）、リボンは完全に Lα 相に変化する可能性があります（図 2G を参照）。 Lα の後、「位相 500 ～ 700 Å」が検出されました。この高次構造は、リボンの長さ以上の格子パラメータを持っています。文献 28、31、73、75、89、90 によれば、そのような構造はスメクティックまたはコレステリック (キラルネマティック) に対応する可能性があります。タンパク質の結晶化プロセスにおけるこの高次構造の正確な役割には疑問があります。「位相500～700Å」は1週間ほど現れ、その後消えます。 Lcryst はタンパク質の結晶の表面に位置し、タンパク質を結晶表面に拡散させる多層膜に相当します。結晶成長が観察されたサンプルでは、Lcryst の出現が結晶の出現に先立っていました。これは、Lcryst がタンパク質の核形成ゾーンにも対応していることを示しています。次に、Lcryst と結晶からの I(q) ピークの強度が同期して成長します (図 S5(A))。最後に、結晶化サンプル中に膜タンパク質の結晶が現れます。

結晶化マトリックスの進化とさまざまな構造要素の連続的な出現/消失を示すスキーム: バイセルと PM の混合物、リボン、ラメラ相 Lα、「位相 500 ～ 700 Å」、局所ラメラ相 Lcryst および BR 結晶(本文の詳細な説明を参照してください)。 Katsaras et al.31 に従って、我々は「位相 500–700 Å」をキラルネマティックとして提示します。ただし、この段階の本当の性質はまだ不明です。軸はそれぞれ時間、複雑さ（つまり、新たに出現した構造要素の数/量）、および濃度に対応します。濃度は任意の単位で与えられます（構造要素の濃度範囲は異なります。ここでは、明確にするために濃度は同じスケールで表示されています。濃度対時間の依存性は定性的に示されています）。

私たちの結果は、メソ MP 結晶化におけるさらなる解明に役立ち、疑問は残りますが、ここで報告された結果は、合理的な設計を使用したこのタイプの結晶化の使用を強力にサポートし、結晶化を大幅に効率化します。このアプローチは、構造に基づいた医薬品設計のための MP の効率的な結晶化、SARS-CoV-2 などのさまざまな病原体に属する MP に基づくワクチンの開発、およびその他の生物医学応用にも役立つ可能性があります。

脂質 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DMPC) は Avanti Polar Lipids Inc から購入しました。 3-([3-コールアミドプロピル]ジメチルアンモニオ)-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート (CHAPSO)、2,5-ヘキサンジオール、トリエチレングリコールは、Sigma-Aldrich から購入しました。

タンパク質/ビセル混合物は、以前に記載された手順に従って調製されました96。ＣＨＡＰＳＯとＤＭＰＣをモル比１：２．６９（ＣＨＡＰＳＯ：ＤＭＰＣ）で混合した。脱イオン水（１８．２ＭΩ・ｃｍ）をこの混合物に添加して、バイセルの最終濃度３５％（ｗ／ｖ）を達成した。混合物を、氷上での周期的な冷却、ボルテックス、短時間の加熱 (40 °C) を通じて均質化しました。調製した混合物を-20℃で保存した。

バクテリオロドプシン (BR) を含む紫膜を、97 に記載されているように Halobium Salinarum 細胞から精製し、BR 濃度が約 10 mg/ml になるまで濃縮しました。冷却した紫色の膜とバイセルの 35% 溶液を 4:1 (v/v) の比率で混合し、穏やかに再懸濁し、氷上に置きました。タンパク質／ビセル混合物の緩衝液組成が０．４９ＭＮａＨ２ＰＯ４、３６ｍＭヘキサンジオール、１．２６％トリエチレングリコールとなるように、沈殿剤溶液を膜／ビセル混合物に１：４（ｖ／ｖ）の比で添加した。沈殿剤溶液には、2.45 M NaH2PO4、180 mM ヘキサンジオール、3.5% トリエチレングリコール、pH = 3.7 が含まれていました。最終的なタンパク質-ビセル溶液を氷上で30分間インキュベートし、毛細管に入れた。最終的なタンパク質/バイセル混合物には、5.6% のバイセル (総濃度 DMPC + CHAPSO) および 8 ～ 9 mg/ml BR が含まれていました (いくつかの一連の毛細管を研究しました)。

標準的な結晶化ツール (シッティングドロップやハンギングドロップなど) は小角度実験を同時に行うのには適していないため、ガラスキャピラリーを使用した同等の結晶化手順を開発しました。

キャピラリーのスキームを図S1に示します。外径 1.5 mm、壁厚 0.01 mm のホウケイ酸ガラス毛細管を使用しました。毛細管の長さは８０ｍｍであった。結晶化システム (BR/ビセル混合物) の毛細管への移送は、外径 1.1 mm、長さ 90 mm の脊椎針を使用して実行されました。キャピラリーを満たす前に、すべての材料 (キャピラリー、針、および溶液) を冷却して、タンパク質 - ビセル懸濁液の液体の粘稠度を確保しました。

タンパク質-ビセル懸濁液をキャピラリーの底に置きました。タンパク質 - ビセル懸濁液と沈殿剤溶液の間に 6 ～ 8 mm の空隙が形成されるように、沈殿剤溶液を上部に置きました。キャピラリーの端はワックスで密封されました (図 S2 および図 1)。

キャピラリーの 1 つのバッチは 32 °C で保管され、もう 1 つのバッチは室温で保管されました。キャピラリーの直径によって制限される蒸発領域が小さいため、室温では結晶化システムの変化が非常に遅いことに気付きました。したがって、4 週間後、すべてのキャピラリーを 32 °C のインキュベーターボックスに置きました。結晶化は32℃で行われました。結晶成長は可視顕微鏡で観察した。

SAXS 実験のほとんどは、モスクワ物理工科大学 (ロシア、ドルゴプルドニ) のリガク装置で実施されました 98。 Riraku SAXS 装置には、40 kV および 30 mA (1200 W) で動作する回転陽極 X 線高束ビーム発生器 (MicroMax 007-HF) に取り付けられたピンホールカメラが装備されていました。Ｘ線の波長λは１．５４Åであった。マルチワイヤガス充填検出器 Riraku ASM DTR Triton 200 (アクティブ領域の直径は 200 mm、ピクセルサイズは約 260 μm) をサンプルから 2.0 m の距離に配置しました (カバーされる q レンジは 0.006 ～ 0.19 Å) −1) および/または 0.5 m (0.024 Å−1 ≤ q ≤ 0.8 Å−1)。得られた 2D 画像の方位角積分は、Saxsgui ソフトウェア (Riraku Innovative Technologies, Inc.、および JJ X-ray System Aps) を使用して実行されました。 1 つのサンプル中の BR 結晶の単位格子を特徴付けるための追加の SAXS 実験が、ESRF (グルノーブル、フランス) の bioSAXS ビームライン BM-29 で実行されました99。 BM-29 (ESRF) の作動エネルギーは 12.5 keV で、実験ハッチにはモジュール長の飛行管 (この実験に使用されたサンプルと検出器の距離は 3.5 m)、2D 検出器 (Pilatus 1 M) を収容する大理石のテーブルが装備されていました。）および自動サンプル交換装置を備えており、達成可能な q 値の範囲は 0.0025 ～ 0.5 Å-1 でした。データ収集、処理、および初期分析は、BsxCuBE と EDNA フレームワーク内の専用ビームラインソフトウェアを使用して自動化された方法で実行されました100。

SANS 測定は、YuMO の時点で、2 つの検出器システムを備えた飛行分光計 (IBR-2、ドゥブナ、ロシア) で実行されました 101,102。検出器の位置はサンプル位置から 4.5 m および 13 m でした。使用された中性子の波長 λ は 0.5 ～ 8 Å、達成可能な q 範囲は 0.007 ～ 0.5 Å−1 です。生データの処理はSASプログラム103で処理されました。

SAXS データから単位セルの寸法を再計算するために、次の関連する不一致の二乗和が最小化されました。

ここで、qexpi は i 番目の実験ピークの位置、qtheor ([hkl]i) は、qexpi に最も近いピーク位置を与えるミラー指数 [hkl]i に対応する理論上のピーク位置です (表 S4 を参照)。単斜晶系の単位胞を持つ結晶の理論上のピーク位置は、次の式 (2) で与えられます。

ATSAS ソフトウェアスイート 104 の Primus プログラムは、SAXS および SANS 1D プロファイル I(q) の一次処理に使用されました。両親媒性分子（単層リポソーム、バイセル、ナノディスク、界面活性剤ミセル、可溶化膜タンパク質）の水溶液の SAXS データは、通常、0.1 ～ 0.2 Å-1 の範囲で最大強度を示します（たとえば、図 2A を参照）。電子密度の強い不均一性によって引き起こされます（通常、疎水性部分は溶媒に対して負のコントラストを持ちますが、親水性部分は正のコントラストを持ちます）。 SAXS によるこのようなシステムの研究では、界面活性剤に可溶化した膜タンパク質複合体 NpSRII/NpHtrII で示された均一な電子密度プロファイルを持つモデルを使用すると、誤差と曖昧さが生じる可能性があります 105,106。したがって、このようなシステムの SAXS データを正しく解釈するには、研究対象のさまざまな部分 (バイセルの場合、脂質二重層のデタージェントベルト、親水性ヘッド、および疎水性テール) の異なる散乱長密度を持つモデルが必要です。この目的のために、2 つのモデルが使用されました。

モデル 1 (バイセルに使用) は、コアシェル散乱長密度プロファイルを持つ円柱です (図 8A を参照。円柱の SasView モデルと core_shell_bicelle に基づくプラグインモデルを使用しました)。 DMPC 二重層の 3S モデルについて以前に報告されたデータ 107 (これは私たちのケースに類似しています) によれば、このコア (Htail) の厚さは 28.8 Å の値に固定できます。既知の脂質あたりの面積 AL = 61.8 Å2 に従って、疎水性コア (ρtail) の SLD を計算して固定できます (表 S3 を参照)。コア円柱の短半径は R、長半径と短半径の比 ε = 1 です。コアの面は DMPC の親水性極ヘッド、および極ヘッドに結合した水分子に対応します。このフェース層の厚さ (Hhead) がフィッティングパラメータです。シリンダーのベルトはCHAPSO製と仮定しました。 CHAPSO 分子 108 の原子モデルに従って、計算におけるベルトの厚さ ΔR は 11.4 Å の値に固定されました。

SAS データの近似に使用されるモデル。 (A) モデル 1: コアシェル散乱長密度プロファイルを持つ円柱 (計算では、バイセルに ε = 1 を使用しました)。 (B) モデル 2: コアシェル散乱長密度プロファイルを持つ楕円柱。

モデル 2 (リボンに使用) は、コアシェル散乱長密度プロファイルを持つ楕円柱です (図 8B を参照。「円柱」カテゴリの 2 つの SasView モデル、core_shell_cylinder と elliptical_cylinder に基づくプラグインモデルを使用しました)。。

バイセルおよびリボンのモデルに適合する SAS 曲線は、SasView 4.2.2 プログラムを使用して実行されました109。前述のモデルの構造パラメーターの最適化は、次の式の最小化によって行われました。

ここで、Nexp と Nparam はそれぞれ実験点の数と近似パラメータです。 (qi, Ii, σi) は SAS 実験データのセットです。モデル曲線 Imodel(qi) の方程式 (4 ～ 7) はテキストドキュメント S1 に記載されています。

計算は、構造因子が無視できる (S(q) = 1) と仮定して実行されました。サンプル濃度が高く (5.6 ～ 14%)、散乱曲線に対する構造因子のある程度の影響は避けられませんが、この影響は物体のタイプを決定する上、特にバイセルを区別する上ではそれほど重要ではありません。そして、作品（19）で実証されたリボン。ただし、フィッティングプロセス中に決定される構造パラメータは実際のものと異なる場合があります。実際、適切な理論モデルがないため、S(q) を正しく考慮する方法はありません。研究対象の構造は濃度に依存し、時間とともに変化するため、希釈を使用し、SAXS 実験に従って、より低濃度での構造因子の影響を考慮することは大きな課題です。したがって、他のサンプル濃度を用いた実験では、膜タンパク質結晶化の実際の実験で発生し、この研究で研究されている系の状態に関する情報を得ることができません。

この原稿の調査結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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ESRF と EMBL-Grenoble のスタッフのビームライン BM29 の使用に対する支援と支援に感謝します。我々は、小角中性子散乱分光計 YuMO (IBR-2) へのアクセスを許可したドゥブナ (ロシア) の JINR の中性子物理学フランク研究所 (FLNP) に感謝します。

TNMは、JINRテーマ04-4-1142-2021/2025（#367/11.05.2021項目17）内のJINRにおけるルーマニア全権の付与を認めます。 Yu.LR と AVV は、ロシア連邦科学高等教育省からの支援を認めます (協定 075-03-2022-107、プロジェクト FSMG-2021–0002)。 AVR は、ロシア連邦科学高等教育省 (契約番号 075-00958-21-05、プロジェクト #730000F.99.1.BV10AA00006) を認めています。タンパク質結晶化法は、ロシア基礎研究財団（プロジェクト番号 19-29-12022）の枠組みの中で開発されました。 SAXS/SANS データの処理は、ロシア科学財団 (プロジェクト番号 21-64-00018) によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Tatiana N. Murugova、Oleksandr I. Ivankov、Yury L. Ryzhykau。

フランク中性子物理学研究所、共同核研究所、141980、ドゥブナ、ロシア

タチアナ・N・ムルゴワ、オレクサンドル・I・イワンコフ、ユーリー・L・リジカウ、ドミトロ・V・ソロビオフ、ダリア・V・スカチコワ、アンドレイ・V・ロガチョフ、アレクセイ・V・ウラソフ、アレクサンダー・I・ククリン

老化および加齢関連疾患のメカニズム研究センター、モスクワ物理工科大学、141700、ドルゴプルドニ、ロシア

タチアナ・N・ムルゴワ、ユーリー・L・リジカウ、ドミトロ・V・ソロビオフ、アンドリー・V・イシュチェンコ、アンドレイ・V・ロガチェフ、アレクセイ・V・ウラソフ、アレクサンダー・I・ククリン

タラス・シェフチェンコ国立大学、キエフ、01033、ウクライナ

オレクサンドル・I・イワンコフ

ウクライナNAS原子力発電所安全問題研究所、キエフ、03028、ウクライナ

オレクサンドル・I・イワンコフ & ドミトロ・V・ソロビオフ

EMBL ハンブルクアウトステーション、22607、ハンブルク、ドイツ

キリル・V・コバレフ

以前は、フランス、グルノーブル、38000 の EMBL-Grenoble Outstation に勤務していました。

アダム・ラウンド

単一粒子、クラスター、生体分子およびシリアルフェムト秒結晶構造解析 (SPB/SFX) 装置、European XFEL GmbH、22869、シェーネフェルト、ドイツ

アダム・ラウンド

生物情報処理研究所 (IBI-7: 構造生化学)、Forschungszentrum Jülich、52425、ユーリッヒ、ドイツ

クリスチャン・ベケン & オレクサンドル・A・ヴォルコフ

JuStruct: ユーリッヒ構造生物学センター、Forschungszentrum Jülich、52428、ユーリッヒ、ドイツ

クリスチャン・ベケン & オレクサンドル・A・ヴォルコフ

構造生物学研究所 Jean-Pierre Ebel、グルノーブルアルプ大学 – 原子力および代替エネルギー委員会 – CNRS、38027、グルノーブル、フランス

ヴァレンティン・ゴルドリー

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TNM、OII、YLR は平等に貢献しており、いずれも書誌文書の最初に自分自身を記載する権利を持っています。概念化: VIG、AIK。実験デザイン: VIG、AIK、TNM、OII、AVI、OAV、AVR; データ収集: TNM、OII、Dm.VS、Da.VS、AR、AIK。データ分析と解釈: TNM、OII、YLR、Da.VS、VIG、AIK。 PM抽出：CB; 監修：VIG、AIK 執筆 - 原案: TNM、OII、YLR、KVK、AVV、AVI、AIK、VIG。執筆—レビューと編集: AR、VIG、AIK

タチアナ・N・ムルゴワ、アレクサンダー・I・ククリン、またはバレンティン・I・ゴーデリとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ムルゴバ、テネシー州、イワンコフ、OI、リジカウ、YL 他。「バイセル」における膜タンパク質の結晶化のメカニズム。 Sci Rep 12、11109 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0

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受信日: 2022 年 3 月 1 日

受理日: 2022 年 5 月 31 日

発行日: 2022 年 6 月 30 日

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