基礎的およびトランスレーショナルアルコール研究のためのアルコール強化の構造化追跡 (STAR)

Molecular Psychiatry volume 28、pages 1585–1598 (2023)この記事を引用

1277 アクセス

18 オルトメトリック

メトリクスの詳細

モデル種における基礎研究の疑問に対処するために開発された方法論と、前臨床から臨床への移行を目的とした方法論との間には、固有の緊張が存在します。基礎調査では、仮説が迅速にテストおよび修正されるため、実験デザインの柔軟性が必要ですが、前臨床モデルでは、標準化されたプロトコルと特定の結果の尺度が重視されます。この二分法は、アルコール使用障害（AUD）の病態生理学を理解するための集中的な取り組みに加えて、さまざまな基礎科学にまたがるアルコール研究に特に関連しています。これらの目標を前進させるためには、非ヒトアルコール研究の基礎領域と橋渡し領域にわたる相乗効果を促進するアプローチが非常に必要とされています。雄と雌のマウスを用いて、モジュール式アルコール強化パラダイムであるアルコール強化の構造化追跡 (STAR) を確立します。 STAR は、トランスレーショナル研究とメカニズム指向の研究間の直接的なクロストークを可能にする柔軟なフレームワーク内で、AUD 関連の行動ドメインの定量的評価のための堅牢なプラットフォームを提供します。研究間の統合を達成するために、課題パラメーターが異質であっても、単純な多変量表現型分析を使用して、アルコール摂取量の増加傾向と罰に対する鈍感さに基づいて被験者を分類します。 STAR と既存の前臨床アルコールモデルを組み合わせて、縦断的な表現型の動態を描写し、皮質および脳幹組織の神経化学プロファイリングを通じてアルコール使用脆弱性の高まりの推定上の神経バイオマーカーを明らかにします。 STAR を併用すると、臨床的に関連する結果の長期的な表現型解析と同時に、基礎研究の疑問に不可欠な時間分解生物行動プロセスの定量化が可能になり、それによってアルコール研究における凝集と翻訳を促進するフレームワークが提供されます。

アルコール (エタノール) は、歴史上最も研究されている化合物の 1 つであり [1]、構造化学 [2]、薬理学 [3]、毒物学 [4]、生理学 [ 5]、進化生物学[6]、神経科学[7]、強化学習[8]。アルコールはその精神活性作用のために広く消費されており [9]、深刻な悪影響は一部の飲酒者にのみ発生しますが [10]、アルコール使用は依然として進行中の世界的健康危機であり、世界中の早期死亡の 5% 以上に関連しています [11]。そのため、アルコール使用障害（AUD）の治療介入を開発するために、アルコール摂取の生物学的影響を理解することを目的としたトランスレーショナル研究および臨床研究において長年の取り組みが行われている[12、13]。しかし、分野を越えた研究者が共通の枠組みでアルコールを調査できる方法論が不足しており、これはおそらく基礎的エンドポイントとトランスレーショナルエンドポイントの両方の進歩を促進する機会を逃していることを意味している。

得られる洞察と進歩を最大化するには、非ヒト対象におけるアルコール研究の非常に多様な下位分野にわたる統合が必要である[14、15]。実際、動物疾患モデルの遡及的評価は、研究者が発見を総合し、サブフィールド全体の連続性を提供するための道を明示的に作成するフレームワークの有用性を示しています[16、17、18、19、20、21]。方法論的解決策の目的を持った開発がなければ、高度に専門化されたパラダイムが部分的に異なる目標に向かって推進されるため、分野が基本的な方向と翻訳的な方向に沿って分裂する自然な傾向があります。基礎的な調査では、仮説が迅速にテストされ修正されるため、実験計画の柔軟性が必要です。一方、前臨床から臨床への移行を目的とした動物モデルでは、特定の結果尺度の比較を可能にする標準化されたプロトコルが重視されています[22、23]。基礎的な実験研究と前臨床試験では、結論を統合するための明示的な努力なしに、重複しない方法論が使用される傾向があり、進歩と翻訳を妨げています[18、24、25、26]。したがって、厳格なプロトコルとは対照的に、概念的な一貫性を維持しながら実験者固有の変更を可能にする柔軟な手順を利用することは、画期的な発見を促進する可能性があります[16、27、28、29、30]。

ここでは、前臨床疾患研究における成功と欠点のメタ分析的評価に基づいて、アルコールの生物行動活性に関する基礎研究とトランスレーショナル研究の橋渡しをするための一貫したモデルを設計することを目指しました。雄と雌のマウスを用いて、アルコール強化の構造化追跡（STAR）フレームワークを確立します。これは、多変量の飲酒結果と経験依存の表現型動態の評価と同時に、アルコールの強化と摂取に関する基本的な質問に対処するためのスキーマを提供します。 STAR フレームワークは、オペラントアルコールの自己投与を利用しており、強化のスケジュールを変更することで、実験者が幅広いプロセスを調査できるようになります [31、32]。 STAR の統一要素は、強化フレームワーク内での予測的妥当性と構築的妥当性を備えた 2 つの結果尺度、つまりアルコール摂取と罰にもかかわらず飲酒の継続の評価です。厳格なプロトコルの代わりに、STAR は多変量表現型分析を実装し、アルコール摂取量と罰の感受性の相対的な分散に基づいて被験者を分類します。グループ正規化値を使用してこれらの行動によって引き起こされる幅広い個人差の発現を記述することにより、さまざまな実験シナリオにわたって堅牢な表現型が一貫して捕捉されます。 STAR は、基礎研究の疑問を追求するために必要な手順の柔軟性に適しており、食欲と完了行動の高解像度の時系列読み取り値を提供し、アルコール強化の生物学的基礎をリアルタイムで調査するための神経テクノロジーとのシームレスなインターフェースを可能にするように最適化されています。重要なことに、STAR フレームワークは、前臨床アルコール分野で開発された既存の多様なモデルとの競合ではなく統合を可能にするように明示的に設計されています [13、33、34、35]。これらの機能は、実験計画に対する制約を最小限に抑えながら、学際的なコミュニケーションを促進し、翻訳価値を高めることを目的としています。

この目的のために、我々はSTARフレームワークを確立してパラメータ化し、一般的なアルコール曝露方法との統合を実証し、公的にアクセス可能なプロトコルリポジトリを提供し、皮質組織と脳幹組織の液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）を組み合わせた分析を利用して神経化学的性質を明らかにする。オーストラリアドル関連の飲酒行動の増加に関連する兆候。私たちは共同して、多変量表現型分類の標準化プロセスを使用して研究間の比較可能性を維持しながら、アルコールのサブフィールドにわたる異種の方法論を通じて得られる知識の蓄積を促進することを目的とした新しいフレームワークを確立します。

STAR フレームワークの設計に情報を提供するために、動物からヒトへの翻訳の可能性を向上させる前臨床モデルの特徴を特定するためのいくつかの分野における最近の取り組みを利用しました。文献における一貫したテーマには、(1) 特定の疾患サブドメインの定量的結果尺度の必要性 (疾患全体をモデル化しようとするのではなく)、(2) 容易に実行できる方法論を介して疾患関連の表現型を定義するためのサンプルの不均一性の利用が含まれます。基礎研究者だけでなく臨床医にも理解されており、(3) 動物およびヒトの被験者全体で生物学的基盤が保存されている行動のエンドポイントがますます強調されている[13、21、24、25、28、29、36、37、38、39]。アルコール摂取と強迫的飲酒（ここでは罰によって摂取が調節される程度として操作的に定義されている）はどちらもAUDの症状の中心であり、動物で容易に定量化できる観察可能な変数である[40、41、42]。我々は最近、マウスの低アルコール摂取表現型、高アルコール摂取表現型、および強迫飲酒表現型を区別する推定上の神経バイオマーカーとして、前頭前皮質から中水道周囲灰白領域に投射するニューロン集団の活動パターンを同定した[43]。その後、これらの発見はヒトを対象とした 2 つの別々の研究で明確に評価され、どちらも皮質脳幹の活動とアルコール使用の脆弱性との間に高度に一致する関係が発見されました [44、45]。これらを総合すると、アルコール摂取と強迫的飲酒によって交差的に定義される個人差を中心とした定量的枠組みが、上記の 3 つの推奨事項を満たす機会となる可能性があるという考えに対する強力な裏付けとなります。ここでは、柔軟な強化学習タスク内でこれらの領域を定量化するためのフレームワークを形式化し、このアプローチを研究室や実験の質問間で容易に移行できるようにする公開プロトコルとリソースを提供します。

STAR フレームワークの必須コンポーネントは、アルコールを入手するには努力が必要なオペラントアルコール自己管理 (図 1A)、およびアルコールの相対分散に基づいて被験者を分類する多変量表現型解析のシンプルで標準化された方法です。罰にもかかわらず飲酒を繰り返す（つまり、強迫的飲酒）（図1B）。罰を受けた場合と罰を受けなかった場合のアルコール自己投与セッション中のアルコール摂取量に基づいて、被験者は次の 3 つの表現型のいずれかに分類されます: (1) 「飲酒量の少ない人」は罰の有無に関わらず平均以下の摂取量を示し、(2) 「飲酒量の多い人」は平均以上の摂取量を示します。 (3) 「強迫的飲酒者」は、罰にもかかわらず平均以上のアルコール摂取量を示します (図 1B)。

A STARフレームワークの主な方法論は、アルコール強化タスク中のアルコール消費量の評価であり、アルコールシッパーを10秒間延長することにより、固定比率10の強化スケジュールの下で反応が強化されます。 B 多様なアルコール強化手順を使用した結果は、アルコール摂取量と罰にもかかわらず飲酒を続けたレベルに基づいて対象を分類するための簡単な表現型分析を使用する共通の概念フレームワーク内に統合されます。 C 実験的なタイムライン。ここでは、STARフレームワークを利用して、時間と飲酒経験に伴う個人差の出現を調査しました。すべての被験者は同一の実験条件下でテストされ、グループの割り当てはテスト後のデータからの表現型に基づいて割り当てられます。 3 回のアルコール自己管理セッションにわたるアルコール摂取量 (D) とオペラント反応 (E)。次に、アルコール強化の罰に対する感受性をテストするために、セッション全体にわたって段階的な濃度のキニーネをアルコール溶液に添加します。続いて、2 ボトル選択手順中に動物にアルコールを自由に摂取させます。これにより、水 (G) と比較して高レベルのアルコール消費量 (F) とアルコール嗜好性が生じます。 STAR表現型セッション中、キニーネ罰の有無にかかわらずアルコール摂取量(H)、およびアルコールアクセスに対するオペラント反応(I)には大きな個人差があった。飲酒量が少ない人、n = 19。飲酒量が多い人、n = 5。強迫的飲酒者、n = 17。エラーバーは SEM を示します。

ここでは、STARフレームワークを実装して、表現型の飲酒行動の発現における長期的な動態と、アルコール摂取と強迫的飲酒によって定義される表現型が他の関連ドメインにどの程度マッピングされるかを調査します。重要なのは、全体を通して説明されているパラメータは、これらの特定の質問を追求するために選択されており、この設計の理論的根拠が全体を通して詳細に説明されているということです。実装を容易にするために詳細なプロトコルと動作コードを提供しました (「方法」を参照) が、表現型解析自体の定義と計算が一貫している限り、当面の質問を最大限に追求するためにパラメーターは必要に応じて変更する必要があります。

我々はまず、アルコール摂取の表現型の違いがアルコールへの最初の曝露中に観察されるかどうかを判断し、雄マウスで飲酒して酩酊する最初の機会に関連するこれらの行動の軌跡を評価しようとしました。強化学習パラダイムで飲酒行動を評価するには、動物はまずオペラント偶発性を学習する必要があり、この時点での行動を明確に解釈するには、オペラント学習をアルコールの動機づけ特性から切り離す必要がある[46]。通常、げっ歯類モデルにおけるアルコール自己投与の獲得は、甘味料の添加 [47] または事前の非偶発的なアルコール曝露 [48,49,50,51] によって促進されますが、いずれも強化と飲酒行動の明確な評価を曖昧にする可能性があります。アルコール使用を開始するまで。これに対処するために、我々は、マウスが甘味料や事前曝露の必要なしにアルコールへのアクセスを獲得するように条件付けされ、オペラント学習基準が満たされるまでアルコール摂取の機会が制限される、制御されたオペラント訓練のためのプロトコルを開発した。消費を制御するために、すべての取得セッションを通じてアルコール摂取量に上限を設け、100 回のなめが記録された場合にセッションを終了しました。標準的なオペラント条件付けチャンバーで、動物はまずアルコール（エタノール水溶液、15% v/v）の入ったシッパーチューブからアルコールを舐めるように訓練され、1時間または100回なめるまでのいずれか早い方で延長されたままになった。その後、アルコールを飲む人にアクセスするために、動物はさまざまな強化スケジュールの下で鼻突きに反応する必要がありました（図S1）。応答は最初、固定比率 1 (FR 1) スケジュールの下で強化され、アクティブなノーズポークに対する 1 回の応答でシッパーチューブが 30 秒延長されました (図 S1A-D)。段階的な基準（「方法」を参照）を使用して、10秒間のアルコールアクセスのFR 5スケジュールの下で動物が活動的な鼻突きと非活動的な鼻突きの明確な区別を示すまで、応答要件が増加し、セッション全体でアクセス期間が短縮されました（図S1E） –L）。

このプロトコルは、低い減少率でオペラントアルコールの自己投与を獲得します（87％獲得、図S2A、B）。さらに、セッションごとの摂取量に一定の制限を課すことにより、初期のアルコール自己投与行動の調査を、学習率の差に関連する複雑な変数とは独立して実行できます。これにより、飲酒傾向自体とは独立して自己管理の増加を促進することができ、制限も可能になります。被験者間の過去の生涯アルコール曝露の分散（図S2C）。アルコールシッパーに登録されたなめる接触数は、最大なめる数を課した場合と課さない場合に分けて、多くのセッションにわたって評価され、消費されたアルコールの容積評価および結果として生じる血中アルコール濃度と高い相関があることが判明したため、信頼性の高い、なめる時間を提供します。 -セッション全体にわたるアルコール消費量の分解された読み取り値（図S3）。重要なのは、この取得プロトコルは、最初の飲酒機会における自己投与行動という当面の実験問題を解析するのに役立ちますが、STAR フレームワークの必須機能ではないということです。全体で説明したように、正規化された表現型解析を使用すると、共通のフレームワークを維持しながら、必要に応じて実験パラメーターを操作できます。

取得基準が満たされると、その後のすべての自己投与セッション中の反応は、シッパーに 10 秒間アクセスする FR 10 スケジュールに基づいて強化されました (図 1A)。動物は、毎日 3 回の 1 時間のセッションにわたってテストされ、被験者が酩酊状態になるまで飲酒する最初の機会におけるアルコールの取得および消費の傾向の個人差を評価するために、獲得セッション中に課されるリックキャップ制約なしでアルコールに反応して飲酒することが許可されました。 (図1D、E)。次に、セッション中に苦味物質であるキニーネの濃度を増加させてアルコールに混ぜ込み（0.25、0.5、0.75、1 mM）、罰に直面したときの飲酒（つまり、強迫的飲酒）を評価しました。アルコール摂取量とキニーネ罰に対する感受性のこの最初の評価は、全体を通して過食前段階と呼ばれます。

AUD などの疾患状態に寄与する多峰性の行動ドメインの考察に加えて [52、53]、臨床研究では、これらの形質の発現における長期的な変化を定量化することの重要性がますます強調されている [54、55、56]。前臨床モデルは、横断的な実験計画の制限を簡単に回避できるため、AUD 関連の行動の進展を縦断的に解析するための独自の有用性を持っています。 [57、58]しかし、飲酒行動の長期的な表現型の動態を定量化する動物研究は不足している[13、59]。この目的を達成するために、次に STAR フレームワークを使用して、時間と経験に伴う飲酒行動の進化を調査しました。自己投与行動の過食前評価の後、暗所飲酒パラダイム [60, 61] に基づいて、マウスに 2 本のボトルを選択する手順でアルコールを自由に摂取させましたが、同時に水も摂取させました。 2 ヘクタールまたは 4 ヘクタールの日 (図 1C)。動物に水のボトルとアルコールのボトルを与えるツーボトル選択は、最も広く実施されているアルコール摂取の動物モデルの1つである[62]。このアプローチには多くのバリエーションがありますが、一般に、オープンアクセスプロトコルは、比較的小さな個人差で高レベルの摂取を引き起こします[43、63]。 2 つのボトルを選択する手順 (図 1F ～ G) で 2 週間のテストを行った後、動物をオペラント条件付けチャンバーに戻し、過食前の自己投与セッションと同じ条件下でアルコール摂取量と罰に敏感な飲酒を評価しました (図 1H–I)。これらのセッションを使用して STAR 表現型解析を実行し、各動物を低飲酒者、高飲酒者、または強迫的飲酒者グループに割り当て、次にグループ割り当てをデータセット全体に適用しました。

過食前の自己投与中、被験者間の差異は限られていました (図 2A)。アルコール摂取における表現型間に差は見られませんでしたが（図 2B）、強迫飲酒者は、混ぜ物の入っていないアルコールを一気飲みする前の自己投与セッション中に、シッパーアクセスに対するオペラント反応の増加を示しました（図 2C）。アルコール飲酒がキニーネの混入によって罰せられた場合、表現型は自己投与において異なり、強迫的飲酒者は低飲酒者および多量飲酒者よりも高い摂取量を示した(図2D)。強迫的飲酒者と飲酒量の多い人は両方とも、キニーネの混入セッション中に飲酒量の少ない人よりも高い反応率を示しました（図 2E）。

A 過食前: テスト前の自己投与セッションからのアルコール摂取量 (y 軸) とキニーネセッション中のアルコール摂取量 (x 軸) の正規化分布。 B 3 回の過食前のアルコールのみの自己投与セッションにわたる摂取量は、表現型によって異なりません (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 6) = 1.691、p = 0.2615; 3 グループ、グループあたり 3 日、合計 122 の値) ）。 C 3 回の暴飲暴食前のアルコールのみの自己投与セッションにわたる積極的な鼻突き反応は表現型によって異なり、強迫性飲酒者の反応が低飲酒者よりも多かった (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 119) = 4.667、p = 0.0112; 3)グループ、グループあたり 3 日、合計 122 の値）。 D 大量飲酒前のアルコール + キニーネ自己投与セッション中の摂取量は表現型によって異なり、低飲酒者または多量飲酒者と比較して強迫的飲酒者の摂取量が多かった (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 161) = 15.31、p < 0.0001; 3 グループ) 、グループあたり 4 日、合計 164 の値）。 E 大量飲酒前のアルコール + キニーネ自己投与セッション中の積極的な鼻突き反応は表現型によって異なり、強迫性飲酒者と大量飲酒者は低飲酒者と比較して高い反応率を示します (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 161) = 20.32、 p < 0.0001; 3 グループ、グループあたり 4 日、合計 164 の値）。 F 過食後: 過食後の自己投与セッションからのアルコール摂取量 (y 軸) とキニーネセッション中のアルコール摂取量 (x 軸) の正規化分布。 G 大量飲酒者および強迫的飲酒者は、低飲酒者と比較して、過食後の 3 回のアルコールのみの自己管理セッションでより多くのアルコール摂取量を示します (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 6) = 20.13、p = 0.0022; 3 グループ、3 日間)グループあたり、合計 122 の値）。 H 高飲酒者および強迫的飲酒者は、低飲酒者と比較して、アルコールのみの自己投与後の 3 回のセッションにわたって、より高い積極的鼻突き反応を示しました (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 120) = 44.15、p < 0.0001; 3 グループ) 、グループごとに 3 日、合計値は 123）。 I 強迫的飲酒者は、多量飲酒者および低飲酒者と比較して、過食後の 4 回のアルコール + キニーネ自己投与セッションでより多くの摂取量を示します (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 9) = 44.90、p < 0.0001; 3 グループ、4 日間)グループあたり、合計 164 の値）。 J 高飲酒者および強迫的飲酒者は、低飲酒者と比較して、大量飲酒後の 4 回のアルコール + キニーネ自己投与セッションにわたって、より高い積極的な鼻突き反応を示します (ネステッド一元配置分散分析、F(2, 161) = 50.92、p < 0.0001; 3)グループ、グループあたり 4 日、合計 164 の値）。すべての事後比較では Tukey の検定を使用しました: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。アルコールのみの日: 3 グループ x 3 日 (低飲酒者、n = 19; 高飲酒者、n = 5 強迫的飲酒者、n = 17)。アルコール + キニーネ日 3 グループ x 4 日 (低飲酒者、n = 19; 高飲酒者、n = 5 強迫的飲酒者、n = 17)。エラーバーはSEMを示します。

表現型は、2 つのボトル選択手順中の総アルコール摂取量に違いはありませんでした (図 S4)。それにもかかわらず、アルコールの自己管理と罰に対する感受性には大きな個人差が、大量飲酒後に現れました（図2F）。罰を受けていないSTAR表現型検査の自己投与セッション中、多量飲酒者と強迫的飲酒者は両方とも、低飲酒者と比較して、より多くのアルコール摂取量とオペラント反応を示しました（図2G、H）。大量飲酒者と強迫的飲酒者は、アルコールのみのセッション中の自己管理行動に違いはありませんでしたが、強迫的飲酒者におけるアルコール摂取は、少量飲酒者と大量飲酒者に比べて罰に対する感受性がはるかに低かった(図2I)。興味深いことに、大酒飲み者と強迫的飲酒者の両方が、摂取量に大きな差があるにもかかわらず、罰セッション全体を通して高い反応率を示したため、オペラント反応に対する罰の影響は摂取量とは分離可能であり、表現型によって異なりました（図2I-J）。重要なことに、表現型行動は被験者の体重の違いとは関連しておらず（図S5）、アルコールの文脈外で味覚嗜好アッセイで提示された場合にはキニーネ回避に差がなかったため、キニーネ自体に対する感受性の違いによるものでもありませんでした（図S5）。図S6)。

これらの結果は、被験者が同量のアルコールにさらされた場合でも、飲酒を繰り返すと、大きく異なる潜在的な行動特性を明らかにする可能性があることを裏付けています。実際、最初のテストで観察された飲酒行動の限定的な違いは、2 本のボトルを選択したテストでは同等のアルコール摂取量にもかかわらず、時間と経験の経過とともに悪化し、大きく異なる表現型を形成しました。さらに、これらのデータは、多変量評価により、一次元の測定では検出されない異なる表現型を明らかにすることを強調しています。たとえば、2 つの形質にわたる共分散によって定義される大酒飲みは、低レベルの飲酒にもかかわらず、罰せられた STAR 表現型セッション中にオペラント反応の亢進を示します (図 2G–J)。摂取と反応の解離可能な尺度は、被験者を評価するための飲酒関連行動の追加の軸を提供し、アルコール使用中に発生する食欲と完了の行動プロセスの個別の評価を可能にする可能性があります[64、65]。

これまでに提示された手順と分析は、複数の臨床関連結果尺度の定量的評価のためのハイスループットプラットフォームを確立し、被験者間および経時的な表現型行動の出現を決定し、直接的な概念的枠組み内で経験的発見を広めることによって、容易に統合することができます。翻訳文献や臨床文献も含まれます。しかし、科学的かつ実践的な観点から見ると、STAR フレームワークがサブフィールド間の結合を促進するには、このアプローチは、多様な実験的疑問や技術的アプローチを持つアルコール研究者にとって魅力的な機能も提供する必要があります。

齧歯動物における現代の神経技術とアルコール飲酒手順との統合は、特定のタスク構造、特殊なハードウェア、および時間分解行動読み取り値の要件により、この分野で継続的な課題となっている[23、66、67、68]。 STAR は、これらの課題を回避するために明示的に設計および最適化されています。アルコール供給と時間的に正確ななめ検出に電動シッパーを使用すると、小型顕微鏡やファイバー測光などのテザリングやヘッドマウントハードウェアを必要とする技術を、手順を変更することなく実装できるようになります[43]。さらに、能動オペランドと非能動オペランドに対する反応、強化された反応、およびアルコールの摂取は、強化の FR 10 スケジュールを使用することによって本質的に時間的に間隔があけられ、複数の刺激にわたる時間分解神経測定の明確な比較が可能になります [23, 66] 。時系列行動データはすべての自己投与セッションを通じて記録され、生体内記録および操作技術とのインターフェース手段、および舐め行動の微細構造パターンなどの飲酒中に発生する粒度の高い行動の評価を提供します（図S7）。

STAR 表現型解析では、セッションごとの単一の測定値として記録されるアルコール摂取量の体積測定のみが必要ですが、時系列測定値を含めることで、詳細な表現型解析の手段も提供されます。たとえば、オペラント応答の累積記録を生成してセッション内データを視覚化できます (図 3A、B)。これにより、全体的な行動の読み取りでは観察できないさらなる表現型の相違が明らかになります。実際、被験者が酩酊するまで飲酒する最初の機会における反応となめる速度の時系列分析は、たとえ差異がほとんどなかったとしても、行動の時間的パターン（一食前の1日目、図3C）における表現型間および表現型内での大きな差異を示している。また、この時点でのアルコール摂取量と反応の総量にグループの差は検出されませんでした（図 2A ～ C を参照）。

行動イベントの正確なタイミングが記録され (1 kHz でサンプリング、ビニングはグラフで示されます)、タスクパラメーターを変更することなく、神経活動を観察および操作する技術やポストホック分析パイプラインとのオンラインインターフェイスが可能になります。 A 15 人の被験者の、過食前の自己期間中の、能動的な応答 (青色、10 秒のビニング)、非活動的な応答 (灰色、10 秒のビニング)、およびなめる (被験者の表現型によって色分け、1 秒のビニング) の応答率の重ね合わせたイベント記録-管理セッション。セッション中の総反応の変動が限られている場合でも、被験者や表現型にわたる個人差が反応の時間的パターンに観察されることがあります。 B 最初の過食前の自己投与セッションからの個々の被験者の活動的 (左) および非活動的 (右) 反応の累積記録。 C 同じセッションからの個々の被験者のリックの累積記録。飲酒量が少ない人、n = 19。飲酒量が多い人、n = 5。強迫的飲酒者、n = 17。

多変量表現型解析は表面的には有用であるが、STAR に不可欠な特定の結果の尺度、つまり単独でのアルコール摂取と罰に直面した場合の摂取が、単一の尺度に加えて洞察を提供するかどうかは、まだ経験的にテストされる必要がある。あるいは、これらの措置は概念的に魅力的な冗長性を単に表しているだけかもしれません。これらの可能性のテストを開始するために、我々は一部の動物をFDA承認のAUD薬物療法薬ナルトレキソンで治療した。これにより一部のAUD患者のアルコール摂取量が減少し、前臨床の2ボトル選択試験でもアルコール摂取量が確実に減少した[33、69]。 STAR表現型セッションの後、被験者のサブセットを、アルコール単独または懲罰付き(0、0.25、0.5 mMキニーネ混入、昇順)について、一連の3回のアルコール自己投与セッションで再検査した。このシリーズは 2 回テストされ、1 回は行動セッションの 30 分前にナルトレキソン治療 (1 mg/kg、腹腔内) で、もう 1 回は生理食塩水で行われました (被験者全体で治療順序をランダムに相殺)。

試験したすべての被験者の合計で、ナルトレキソン治療は、生理食塩水治療と比較して、罰を受けていない自己投与中のアルコール摂取量を減少させることを発見しました（図S8A）。対照的に、キニーネ懲罰セッション中に摂取量はいくらか減少しましたが、これらの効果はどちらの懲罰セッションでも統計的有意性に達しませんでした（図S8B、C）。さらに、積極的な鼻突きに対するオペラント反応は、アルコールのみまたはキニーネ罰セッション中のナルトレキソン治療によっても変化しませんでした（図S8D–F）。データを被験者の表現型ごとに分けると、ナルトレキソンによる罰せられないアルコール摂取量の減少は強迫性飲酒者によって引き起こされたが、低飲酒者ではナルトレキソンの効果は観察されなかったことが明らかになった（図S9A）。ナルトレキソンは、懲罰セッション中の摂取や、いかなるセッションタイプ中の能動的な反応にも影響を及ぼさなかったにもかかわらず、強迫的飲酒者は被験者間で非常に大きな差異を示しました（図S9B-F）。まとめると、これらの結果は、自己投与中のアルコール摂取は一般に逆変換可能性を示すという以前の研究と一致します。重要なことに、彼らはまた、STARフレームワークが飲酒関連行動の解離可能な軸全体にわたる追加情報を提供し、被験者内での多面的な対策を考慮することで、アルコール摂取だけでは重複しない大量の情報が提供されるという考えを支持している。

次に、STAR 表現型解析が、分析自体では明示的ではない行動ドメイン全体にわたる意味のある差異を捕捉するかどうかを判断しようとしました。これを調査するために、我々はアルコール条件刺激の影響に焦点を当てた。この刺激は、アルコールの不在下で探索行動を引き起こす可能性があり、このプロセスは継続的なアルコール摂取とは別のものであり、再発事象を引き起こす上で極めて重要であると考えられている[65, 70]。 STAR は、動物がアルコール摂取に関連する状況に応じた個別の合図を学習するオペラント手順を利用しているため、オペラントの消滅率やアルコール条件付き合図の動機付けの強さを、特定の実験質問の必要に応じて容易にテストできます。 STAR表現型セッションの完了から2週間後、動物は消去手順の1日2セッションで消去抵抗性がテストされ、その後、アルコール関連刺激の動機の強さをテストするために条件付け強化の2セッションが続きました（図4A）。絶滅セッション中、反応は何の影響も及ぼさず、シッパーチューブは決して延長されませんでした。条件付き強化セッションでは、アクティブ側の最初の反応が強化され、その後、残りのセッションではスケジュールが FR 10 に戻りました。反応はシッパーを10秒延長することによって強化されますが、シッパーは乾燥/空であり、セッション中にアルコールを取得できません。ただし、残りの実験パラメータは表現型セッション中のものと同一でした。

実験的なタイムライン。消去：STAR手順と表現型解析（図1）の完了後、以前に活発だった鼻突きに対する反応が影響を及ぼさない消去条件下で動物の反応をテストします（セッション1〜2）。次に、アルコール探索の尺度として、アルコール関連合図に対する条件強化反応を決定するために動物がテストされます（セッション 3 ～ 4）。条件付き強化（アルコールシーク）：条件付き強化中、能動的鼻突きに対する最初の反応はシッパーの提示をもたらし、両方のセッションの残りの反応は固定比率10の強化スケジュールの下で強化されます。最初のプレゼンテーションに続く偶発性は、シッパーに液体が含まれていないことを除いて、過食前および STAR 表現型検査の自己投与セッションと同じです。したがって、反応率は、不在時のアルコール要求の尺度として使用されます。アルコールへのアクセス。 B 以前にアクティブだった消去セッションに対する鼻突きセッションでの反応の個別 (左) および平均 (右) 累積記録 (2 つの 60 分間セッションが 1 つの記録に連結され、点線で示されています)。 C 2 回の消去セッションにおける、以前にアクティブであったノーズポークと非アクティブであったノーズポークに対する反応。最初の絶滅セッション中、飲酒量の多い人は、飲酒量の少ない人に比べて、以前に活発だった鼻突きに対してより大きな反応を示しました (二元配置分散分析、鼻突き F(1, 12) = 18.26、p = 0.0011; 表現型、F(2, 12) = 2.067、p = 0.1693; 鼻突き x 表現型 F(2, 12) = 2.040、p = 0.1727)。 2 回目の消去セッション中、ノーズポークの主効果は残りましたが、表現型間に差異は検出されませんでした (二元配置分散分析、ノーズポーク F(1, 12) = 19.08、p = 0.0009; 表現型、F(2, 12) ) = 1.695、p = 0.2248;鼻突き x 表現型 F(2, 12) = 1.377、p = 0.2895)。 D 条件付き強化セッションにおける能動的ノーズポークの反応の個別 (左) および平均 (右) 累積記録 (2 つの 60 分のセッションが 1 つの記録に連結され、点線で示されています)。 E 2 つの条件付き強化セッションにおけるアクティブなノーズポークと非アクティブなノーズポークに対する反応。多量飲酒者と強迫的飲酒者は、最初の両方で低飲酒者と比較して積極的な鼻突きに対してより多くの反応を示しました (二元配置分散分析、鼻突き F(1, 12) = 29.24、p = 0.0002; 表現型、F(2, 12) = 3.644、p = 0.0580; ノーズポーク x 表現型 F(2, 12) = 4.118、p = 0.0435) および 2 番目 (二元配置分散分析、ノーズポーク F(1, 12) = 45.97、p < 0.0001; 表現型、F(2, 12) = 4.080、p = 0.0445; 鼻突き x 表現型 F(2, 12) = 4.674、p = 0.0315) セッション。すべての比較では Tukey の検定を使用しました: *p < 0.05; **p < 0.01。飲酒量が少ない人、n = 4。飲酒量が多い人、n = 5。強迫的飲酒者、n = 6。エラーバーは SEM を示します。

消去中、飲酒量の多い人は、最初の消去セッションでは低飲酒者よりも以前にアクティブだったオペランドに対してより多く反応しましたが、2回目の消去セッションでは反応しませんでした（図4B、C）。これは、飲酒量の多い人の表現型がアルコールに対する反応の消去に対する抵抗と関連していることを示唆しています。条件強化中、動物はアルコール関連刺激へのアクセスを獲得するために強力な反応を示し、一部の被験者は2回の60分間のセッション中に数百回反応しました（図4D）。大量飲酒者と強迫的飲酒者の両方が、両方のセッションにわたって低飲酒者よりも高い反応を示し（図4E）、これは、大量飲酒者と強迫的飲酒者の表現型メンバーシップが、アルコールへのアクセスがない場合に測定されたアルコール条件強化行動の高まりを予測することを示しています。これらのデータを総合すると、STAR フレームワーク内で対処できる多様な研究上の疑問がさらに実証され、関連する行動ドメインの差異を予測する意味のある表現型を捕捉するための STAR 表現型解析法の有用性が強調されます。

STAR フレームワークの重要な要素はそのモジュール性であり、同一の実験条件下で実行された被験者から得られたグループ平均のパーセントとして正規化された値に基づいて表現型が決定されるようなグループ正規化に基づいています。個人差の他の分析と同様に、サンプルサイズは分析結果の主な決定要因であり、グループの正規化により被験者数の潜在的な影響がさらに増幅される可能性があります。したがって、サンプルサイズの関数として STAR 表現型解析の安定性を決定することは、研究室全体で実装できる共通のフレームワークとしての STAR 表現型解析の有用性にとって最も重要です。この目的を達成するために、完全なデータセットのランダムなサブサンプリングによってさまざまなサイズのサンプルを繰り返し生成する順列リサンプリングテストを実装しました (サンプルサイズ 2 ～ 41 人の被験者、それぞれ 100 回の反復)。各サブサンプルは、グループの正規化が毎回再決定されるように独立して分析され、サブサンプル分析から得られた表現型の割り当てが完全なデータセットから作成された表現型の割り当てと比較されました。したがって、順列検定により、サンプルサイズの関数として表現型の割り当てが変化する経験的確率が決定されました（補足ビデオ1および図S10A）。サンプルサイズが被験者12人以上になると、表現型の割り当てがデータセットで非常に安定することを示します（図S10B）。研究室全体で STAR 表現型検査を実装する際のベストプラクティスとして、STAR 表現型検査を実行する前に、デフォルトの最小サンプルサイズを少なくとも 15 人の被験者とし、同一の実験条件下でテストすることをお勧めします。この推奨事項は出発点として意図されており、その後、実験上の質問や観察された変動に合わせて正確な統計パラメータを調整できます。

上で議論したように、前臨床モデルに関するメタアナリティクス文献からの主な推奨事項は、動物とヒトの被験者全体で生物学的基盤が保存されている行動のエンドポイントをさらに重視することです。もちろん、これは広範な目標であり、単一の実験では対処できず、単一のバイナリソリューションが得られることも期待できません。それでもなお、この目標に向かって前進することが最も重要です。したがって、我々は次に、ヒトの飲酒行動の個人差を区別する要因との一致性を継続的に評価するための基礎を提供するという全体的な目標を持って、STAR表現型を区別する可能性のある潜在的な神経生物学的マーカーを探索しようとしました。我々は以前、背側中水道周囲灰白質領域（dPAG）に投射する内側前頭前皮質（mPFC）ニューロンの光遺伝学的操作が、強迫的飲酒行動の双方向調節を引き起こすことを実証した[43]。その後、ヒト被験者を対象とした 2 つの独立した神経画像研究で、我々の結論に基づいてアプリオリな仮説が明確に評価され、強迫的飲酒行動に対する脆弱性の神経バイオマーカーとして皮質脳幹の活動が関係していることを示唆する非常に一致した所見が判明した [44、45]。したがって、我々は、AUD 関連行動の生物学的基礎のサブフィールド横断的研究を進めるために、mPFC と dPAG に焦点を当てました [43、44、45、71]。

動物間の飲酒行動の差異を説明できる可能性のある神経バイオマーカーを探索するために、液体クロマトグラフィーと質量分析の組み合わせ（LC-MS）を使用して、STAR手順に従って神経化学スクリーニングを実行しました。最後のアルコール自己投与セッションの 24 時間後に動物を屠殺し、分析のために mPFC と dPAG のサンプルを収集し、LC-MS を介して 15 人の被験者の領域ごとに 23 種類の神経伝達物質、前駆体、代謝産物の濃度を測定しました (表S1–3)。まず、各分析物の濃度を 2 つの STAR 表現型評価指標 (正規化されたアルコール摂取量またはアルコール + キニーネ摂取量) と個別に相関させることにより、アルコール摂取量の増加または罰に抵抗するアルコール摂取量の潜在的なマーカーを評価しました (図 5)。 mPFC では、5-HT、その一次代謝産物 5-HIAA、およびドーパミン代謝産物 DOPAC のレベルはすべて、アルコール単独の摂取と正の相関があることがわかりました (図 5B)。 23の分析物のいずれのmPFCレベルと被験者のアルコール+キニーネ摂取量の正規化値との間に有意な関係は見つからず、mPFCが強迫的飲酒よりも多量飲酒の特徴を区別する際に大きな役割を果たしている可能性があることを示唆しています。 dPAG 組織では、アルコール摂取は、5-HT およびドーパミンおよびその代謝産物の濃度の増加、ならびに GABA およびグルタミン酸の濃度の増加と関連していました (図 5C)。 mPFCとは対照的に、興奮性（グルタミン酸、アスパラギン酸）および抑制性（GABA）伝達物質およびその前駆体（グルタミン）の濃度は、アルコール+キニーネ摂取値と正の相関があることがわかりました（図5C、追加データについては図S11を参照）視覚化）。これらの結果は、dPAG の興奮性/抑制性バランスが AUD の脆弱性および AUD 内の表現型の重要な決定因子であることを示唆する Jia らの結果 [44] と一致しています。

A 最後のアルコール自己投与セッションの 24 時間後に動物を屠殺し、液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) を使用した分析用に mPFC および dPAG のサンプルを調製しました。各領域で 23 の分析対象物が定量化され、アルコールのみおよびアルコール + キニーネセッションのポストテストセッション中の分析対象物と自己投与との関係を決定するために相関関係が実行されました。各相関の B、C r 値は、円の大きさと色で示されます。統計的に有意な相関にはアスタリスクが付いています。表現型別の各分析物の濃度は、補足表 1 ～ 3 に示されています。 B mPFC では、アスパラギン酸、システイン、5-HIAAA、5-HT、DOPAC とテスト後のセッション中のアルコール自己投与の間に正の相関関係がありました。テスト後のアルコール+キニーネセッション中の摂取量と相関する分析物はありませんでした。 C dPAG では、いくつかの分析物とアルコールのみの自己投与の間に強い相関関係がありました。さらに、アスパラギン酸、GABA、グルタミン酸、およびグルタミンの濃度は、アルコール+キニーネの摂取量と正の相関がありました。スピアマンの相関係数: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。飲酒量が少ない人、n = 4。飲酒量が多い人、n = 5。強迫的飲酒者、n = 6。

男性と女性の両方の被験者を調査する研究は、基礎研究と橋渡し研究にとって重要です[72、73]。したがって、メスのマウスについても、同じパラメータがメスのマウスにおけるアルコール強化の個体差の確実な評価を提供するかどうかを決定するために、上記のオスの被験者について記載したのと同じ方法論を使用してSTARフレームワークでテストした。同じ獲得手順を使用して、女性被験者（図S12）はアルコールに対するオペラント反応を容易に獲得しました（92％が基準を満たしました、図S13A）。男性対象と同様に、表現型は獲得までの日数や獲得全体の総アルコール摂取量に違いはありませんでした（図S13C、D）。取得後、女性被験者は上記と同じ条件下でテストされ、最初に酩酊するまで飲酒する最初の機会での自己投与行動を評価し、次に2週間の暴飲暴食プロトコルの後にSTAR表現型検査を実施しました（図S14）。

雄マウスの所見を反映して、雌マウスではアルコール摂取の表現型間に差は見られませんでしたが（図S15B）、強迫飲酒者は、混ぜ物が入っていないアルコールの大量摂取前の自己投与セッション中に、一口アクセスに対するオペラント反応の増加を示しました（図S15C）。。キニーネの不純物混入によってアルコールが罰せられた場合、自己投与では表現型が異なり、強迫的飲酒者は低飲酒者よりも高い摂取量を示しました（図S15D）。強迫的飲酒者と飲酒量の多い人は両方とも、キニーネの混入セッション中に飲酒量の少ない人よりも高い反応率を示しました（図S15E）。

メスのマウスでは、2つのボトルを選択する手順の間、表現型はアルコール摂取量または好みと水の違いがありませんでした（図S16）。それにもかかわらず、男性被験者と同様に、アルコールの自己投与と罰に対する感受性における幅広い個人差は、暴飲暴食後に行われたSTAR表現型セッション中に明らかに明らかでした（図S15F）。 STAR表現型自己投与セッション中、多量飲酒者と強迫的飲酒者は両方とも、低飲酒者と比較して、より多くのアルコール消費量とオペラント反応を示しました（図S15G、H）。大量飲酒者と強迫的飲酒者は、アルコールのみのセッション中の自己管理行動に違いはありませんでしたが、強迫的飲酒者のアルコール摂取は、少量飲酒者と大量飲酒者に比べて罰に対する感受性がはるかに低かった(図S15I)。さらに、強迫飲酒者は、アルコール+キニーネセッション中に、低飲酒者よりも高いオペラント反応を示しました(図S15J)。重要なことに、男性の場合と同様、表現型行動は被験者の体重の違いとは関連しておらず（図S17）、キニーネ自体に対する感受性の違いによるものでもありませんでした。これは、屋外の味嗜好性アッセイで提示された場合、キニーネ回避に差がなかったためです。アルコールの文脈（図S18）。まとめると、これらの結果は、STAR が男性と女性の両方の被験者に対して堅牢なテストを可能にすることを示しています。 STAR を実装するための詳細なプロトコル、コード、および関連リソースは無料で利用可能です (https://github.com/Siciliano-Lab/STAR)。

前臨床モデルの開発と臨床エンドポイントに向けた進歩は、アルコール分野の長年の強みです。数十年にわたる公開の議論と、多様なモデル種を通じた順方向および逆方向の変換により、動物モデルの厳密な最適化が着実に推進され、最終的には AUD に対して承認された複数の薬物療法介入が生み出されました [33、35、74、75]。しかし、臨床目標が個別化された投薬戦略に移行するにつれて、個人差を捉え、AUD スペクトル内の特定の行動の多峰性評価を組み込んだアルコール使用の前臨床モデルの必要性が高まっています [52、53]。同時に、生体内での細胞活動をリアルタイムで調査するための神経技術の進歩により、行動神経科学は急速に変化しましたが、確立された AUD モデルと互換性がないことが多く、その結果、この分野全体で方法論の相違が生じています [43、76、77]。ここでは、これらの問題に対処するために、アルコール強化の構造化追跡のアプローチを確立します。我々は、(1) STAR 表現型解析が、多峰性の行動ドメインにわたる縦断的ダイナミクスから意味のある分類を抽出するための容易に応用可能な方法を提供することを検証し、(2) 確立された前臨床モデルの組み込みを含む一連の実験的問題を柔軟に追求するための STAR のモジュール性を実証します。 3) mPFC および dPAG の神経化学プロファイリングにより、アルコール使用脆弱性の複数の潜在的なバイオマーカーを特定します。

強化学習は分野を超えて広く利用され理解されており、人間の実験室での実験を含め、パラダイムや種を超えて発見を評価できるようになります[78、79]。 STAR フレームワークでは、自発的なエタノール摂取と罰に抵抗する飲酒がオペラント強化タスクで評価されます。オペラント強化条件下でのアルコール摂取量と罰への耐性の測定、およびその後の表現型解析アプローチは、STAR の 2 つの中心要素です。オペラントフレームワーク内に追加のテストを組み込んだり (条件付き強化など)、または他のアッセイと組み合わせたり (2 つのボトルの選択など)、実験上の疑問点はいくつでも柔軟に対処できます。表現型解析自体は、完全に厳密な唯一のコンポーネントです。研究間での比較を可能にするために、計算を同一に実行することをお勧めします (メソッドとオンラインリポジトリを参照)。

STAR は、前臨床モデルに有利な機能として分野全体で特定されているいくつかの基準を満たしています。私たちは、アルコール摂取量と罰にもかかわらず飲酒の差異が、低飲酒者、高飲酒者、強迫的飲酒者と呼ぶ 3 つの表現型を定義することを示します。重要なのは、この比較的単純なアプローチは、表現型解析には含まれていなかった AUD 関連の結果測定値全体の分散を捕捉することです。たとえば、これらの表現型は、アルコール自己投与、絶滅抵抗、およびアルコール探索中のオペラント反応率も異なります。さらに、これらの測定値は、表現型間で異なって現れるアルコール強化内の解離性プロセスを読み取っているようです。上で述べたように、この構造化により、同じフレームワークをさまざまなアプリケーションに使用できるようになり、前臨床トランスレーショナルパイプラインに役立つ正式なフレームワークとともに、特に基礎科学の質問に必要な柔軟性が得られます。

消滅および条件強化アッセイは、STAR の必須コンポーネントではありませんが、アルコール探索行動の確実な読み取り値を提供します。薬物関連刺激に対する反応は、薬物渇望の尺度として覚醒剤の文献で広く使用されていますが、特にマウスでは、アルコール条件付き反応のプロトコルはそれほど確立されていません。興味深いことに、ほとんどの被験者は 2 回目の条件付き強化セッションでより高い反応率を示していることがわかります。我々は、この効果は、前臨床コカインの文献で広く研究されている「インキュベーション」現象に類似しているのではないかと推測している。この現象では、薬物条件刺激に対する反応が、禁欲期間中に時間依存的に増加することが示されている[80、81]。この場合、反応の増加はアルコール条件付け強化因子への曝露に応じて起こるようであり、これは純粋に時間に依存する現象というよりも臨床文献に類似している可能性がある[82、83]。重要なのは、根底にある心理的要因に関係なく、消去条件下での反応は2つのセッションの過程で減少したため、この効果は条件強化子の提示によって引き起こされることです。

このタスクを使用して、時間の経過とともに出現する個々の表現型を解析し、この表現型の相違に対する潜在的なバイオマーカーを特定します。 LC-MS を使用して mPFC および dPAG の一連の分析対象物を評価したところ、mPFC と dPAG の両方におけるドーパミンおよび 5-HT 関連分析対象物は、アルコール自己投与中の摂取量と正の相関があるが、相関関係は存在しないことが示されました。スクリーニングされた 23 個の分子のいずれかの濃度と、罰せられたセッション中のアルコール摂取量との間の関係。対照的に、dPAG の興奮性および抑制性伝達物質は、強迫性飲酒と正の相関がありました。これらのデータは、モノアミン活性が多量アルコール摂取の広範なバイオマーカーである可能性があることを示唆しており、これは、複数の脳領域および循環CSFで観察できる大量飲酒者におけるドーパミンおよび5-HT活性の上昇を実証する複数の臨床研究と一致している。さらに、dPAG 活性が強迫性飲酒行動に対する脆弱性のバイオマーカーであり、強迫性と多量飲酒の表現型を区別する神経生物学的基質を表す可能性があるという証拠が増えている[43、44、45、84]。

私たちは並行実験で雄と雌の両方のマウスでSTARを使用することを確立していますが、可能性のある性的二型を明確に解釈するには追加の実験が必要であると考えているため、結果の尺度に対する性別の影響の直接的な分析は報告していません。。定性的には、メスのマウスは一般に、自己投与セッション中にオスよりもかなり低いアルコール摂取量を示しました（図1および図S14を参照）。したがって、オスの方がメスよりもアルコールを摂取する傾向が高いという結論が導き出されます。ただし、同じ動物で 2 つのボトルを選択する場合、これらの違いはすぐにはわかりません (図 S4A および S16A を参照)。これは、女性のほうが自己投与率が高いという長年の見解にも関わらず、薬物を入手するのに努力が必要な場合や、薬物を入手するために必要な薬物として提示された場合には、この関係が解消されるか逆転することを示す、コカインとオピオイドの両方の文献における最近の発見を彷彿とさせる。強化子間の個別の選択 [85,86,87]。私たちや他の人々は最近、薬物やアルコールの自己投与データを解釈する際に、性的二形性の主張よりも、性と環境の相互作用をより重視するよう求めている[88、89、90]。 STAR は、今後の女性被験者の調査のためのプラットフォームを提供するだけでなく、特に性差を調査する際の性別 x スケジュール x 環境の相互作用を解析するための定量的フレームワークも提供します。提示された実験は、潜在的な性特異的影響を解析するように設計されたものではないため、そのように解釈しないように警告します。むしろ、これらの並行実験は、男性と女性の両方の被験者を調査するための STAR の使用を確立することを目的としていました。このアプローチの真実性は、どちらの場合でも表現型を明確に分離できること、および表現型のメンバーシップが、表現型分析自体には含まれていない行動変数 (レバーを押すなど) に顕著な類似性を持ってマッピングされるという事実によって裏付けられています。男女。

私たちは一緒に、アルコールの生物学的活性に関する基本的な疑問に対処するための新しい枠組みを確立し、サブフィールド間の結束を促進してAUDのより深い理解をもたらすことを期待して、このプロトコルを自由に利用できるようにします（リソースリポジトリの方法を参照）。我々は、男性と女性の両方における時間と経験に基づくAUDおよび他のSUDの発達を研究するための新しい柔軟なモデルとしてSTARを提案します。 AUD の開発全体にわたる個人差を追跡する単一のタスクを持つ機能は、依然として重要です。 STAR は柔軟性があり、既存のテクノロジーやツールと簡単に統合できるため、行動、回路、人口の観点からアルコール使用と強迫の増加に関する個人の発症を研究するための強力なモデルになります。

雄および雌の C57BL/6 J マウスをすべての実験に使用しました (Jackson Laboratory)。動物は生後 8 週目に到着し、検査を行う前に少なくとも 1 週間施設に順応させました。動物を5匹のグループに分け、12時間の明暗サイクルを逆転させ、水を自由に摂取させて飼育した。実験期間中健康な成人の体重が維持されるように、必要カロリーをわずかに上回る量の固形飼料（Picolab 5L0D、LabDiet）を毎日与えました（雄：2.9 ～ 3 g/動物/日、雌：2.6 ～ 2.7 g/動物/日）、男性被験者と女性被験者の場合、それぞれ 1 日あたり約 8.7 kcalME と 7.5 kcalME に相当します) [91、92]。動物の使用を伴うすべての実験は、NIH ガイドラインに従っており、ヴァンダービルト施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

全てのコンディショニング実験は、オペラントコンディショニングチャンバー(Skinner box、Med Associates)内で実施した。 2 つの照明付きノーズポークポートを、格納可能なシッパーチューブ (Med Associates、ENV-352AW) を備えた報酬ポートの両側に配置しました。鼻の突きは赤外線ビームブレイクによって検出され、なめは抵抗リックメーター（Med Associates、ENV-250C）によって検出されました。すべてのセッションは動物の暗サイクル中に暗闇で実行され、マウスは頭上の赤外線カメラ（セキュリティカメラ倉庫）によって継続的に監視されました。

被験者は1日1回、1時間のセッションで検査を受けました。特に明記しない限り、95% ストックから調製し、超純水で希釈した 15% エタノール (v/v) を使用しました。マウスは毎日のセッションの終わりに体重を測定され、すべての動物がその日の実験を完了した後に餌を与えられました。ノーズポークは各セッションの開始を知らせるために点灯され（マガジントレーニングを除く）、非アクティブなノーズポークに対する反応は全体を通じてプログラムされた結果をもたらさなかった（アクティブ側は動物間でカウンターバランスされた）。

取得中、動物が 100 回の舐めに達したとき、または 1 時間後のいずれか早い方でセッションを終了しました。取得は、以下に説明する 3 つのフェーズで実行されました。いずれかのフェーズ中に動物が連続 3 セッションの基準を満たさなかった場合は、次のフェーズに進むための基準が再び満たされるまで動物を前のフェーズに戻した。被験者が合計 3 回前のフェーズに戻された場合、被験者は実験から除外されました (獲得/減少率については図 S2 および S12 を参照)。

シッパーチューブを常に伸ばした状態で、動物をオペラント条件付けチャンバーに入れました。 100 リックの上限に達したら、シッパーを引っ込め、被験者は翌日オペラント条件付けの習得に移りました。

基準 1: FR 1 スケジュールの下でシッパーを 30 秒間延長することにより、積極的なノーズポークへの反応が強化されました。 2 日連続で 100 リックの上限に達したら、動物を 2 番目の基準に移しました。

基準 2: FR 1 スケジュールに基づいて対応が強化され続けましたが、アクセス期間は 10 秒に短縮されました。２日連続で１００リックの上限に達したら、動物をオペラント弁別段階に移した。

応答要件は、10 秒のアクセスに対する FR 5 スケジュールに引き上げられました。動物は、「アクティブ」側で 70% 以上の応答率 (アクティブ/[アクティブ + 非アクティブな応答]) を示し、連続 2 セッションで 100 リックの上限に達した時点で獲得したとみなされました。

取得完了の翌日、動物は 1 日あたり 1 時間のセッションを実行し (リックキャップなし)、セッションはパフォーマンスに関係なく固定された順序で進行しました。 FR 10 スケジュールの下では、全体を通して 10 秒間シッパーを提示することで、反応が強化されました。

1 ～ 3 日目、シッパーには 15% (v/v) のエタノールが含まれていました。 4 ～ 7 日目には、セッションごとに濃度を増加させてエタノールにキニーネを混ぜました (15% EtOH 中 250、500、750、および 1000 μM)。

過食前の期間が完了した翌日、確実に過食レベルの摂取をもたらすことが知られている2本選択手順で動物にアルコールを摂取させた[43、93]。動物を個別に清潔なホームケージに入れ、30 分間順応させた後、15% エタノール (v/v) または水のいずれかを含む 2 本のボトルをケージの上部に置き、注ぎ口がケージ内に伸びるようにしました (数日かけて側面のバランスを取り、暗サイクル開始後 2 時間でボトルをオンにします）。最初の 4 日間は動物に 2 時間のアクセスを与え、5 日目には動物に 4 時間のアクセスを与えました。次の 2 日間は動物を元のホームケージに留めた禁欲日でした。この 1 週間のサイクル (2 時間のアクセスを 4 日、4 時間のアクセスを 1 日、および禁欲を 2 日) を繰り返しました (合計 14 日間)。

STAR表現型セッションは、過食期の禁欲最終日の翌日から開始した。実験の構造とパラメータは過食前の時代と同じでした。

STAR 表現型分析を実行するには、動物ごとに 2 つの値を計算し、サンプル平均のパーセントとして表します: (1) 3 回のアルコールのみのセッションで摂取した被験者の平均 g/kg [アルコール摂取量 = (被験者のセッション 1 ～ 3 の平均 (g/ kg)/1 ～ 3 日目の全被験者の平均 (g/kg))*100]、および (2) 4 回のアルコール + キニーネセッションにわたる被験者の平均 g/kg [アルコール + キニーネ摂取量 = (被験者のセッション 4 ～ 7 回の平均 ( g/kg)/4 ～ 7 日目の全被験者の平均 (g/kg))*100]。アルコール摂取量およびアルコール+キニーネ摂取量の計算値に基づいて、動物は 3 つの表現型の 1 つに割り当てられます。アルコールおよびアルコール+キニーネの両方の値が平均より低い動物は、「低飲酒者」とみなされます[アルコール<100%およびアルコール+キニーネ<100%]。平均アルコール摂取量を上回っているが、平均アルコール+キニーネを下回っている値を持つ人は、「多量飲酒者」とみなされます[アルコール > 100% & アルコール + キニーネ < 100%]。平均以上のアルコール+キニーネ値を持つ動物は「強迫的飲酒者」[アルコール+キニーネ > 100%]とみなされました。視覚化するには、すべての動物の値を散布図としてプロットすることをお勧めします。ここで、x = [アルコール+キニーネの値]、y = [アルコールのみの値]です。

消滅中、シッパーチューブはアルコールで満たされ、以前のセッションと同じ拡張可能なシッパー内に配置されましたが、ノーズポークはどちらの側も強化されておらず、シッパーは全体を通して格納されたままでした。動物はこれらの条件下で毎日 1 時間のセッションを 2 回連続してテストされ、続いて 2 日間の条件付け強化テストが行われました。条件付き強化中、シッパーチューブは空/乾燥状態のままでしたが、通常どおり格納式ポート上に配置されました。活動側の最初の鼻突きにより、10 秒間ドライシッパーが提示されました。最初のプレゼンテーションの後、残りのセッションではドライシッパーへの 10 秒間のアクセスに対する応答要件が FR 10 に引き上げられました。

すべての実験が完了した後、一部の動物は最終日のアルコール自己投与を実施した（FR 10 → 10 秒間のシッパーアクセス、1 時間のセッション）。最後の自己投与から合計 24 時間後に動物を屠殺し、脳を瞬間冷凍し、その後クライオスタット (Leica) 上で 200 ミクロンのスライスに切片化しました。組織パンチ (直径 500 ミクロン) を使用して、スライスから mPFC および dPAG のサンプルを取得し、分析直前まで -80 °C で保存しました。簡単に説明すると、組織パンチを均質化し、LC/MS を使用して各サンプルから 23 種類の対象分析物を同時に定量し、分析物濃度をサンプルの総タンパク質含有量に対して正規化しました (詳細については補足方法を参照)。

統計分析は、GraphPad Prism (V9) を使用して実行されました。 3 つ以上の変数間の比較は、一元配置 ANOVA または二元配置 ANOVA を使用して行われました (計画された比較が行われた場合、または相互作用が検出された場合は、その後に Tukey の検定が行われました)。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。

オペラントボックスを制御するためのプログラムと詳細な標準操作手順は、オペラント条件付けの経験が豊富でない研究者でもアクセスできるように設計されており、https://github.com/Siciliano-Lab/STAR から入手できます。

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この研究は、NIH 助成金 R00 DA04510 (NIDA)、R01 AA030115 (NIAAA)、U01 AA029971 (NIAAA)、Alkermes Pathways Research Award、脳研究財団、ホワイトホール財団 (CAS) によって支援されました。 PRM は NIH フェローシップ (F31 AA029626) によってサポートされています。

ヴァンダービルト脳研究所薬理学部門、ヴァンダービルト大学依存症研究センター、ヴァンダービルト大学、ナッシュビル、テネシー州、37232、米国

アレックス・R・ブラウン、ハンナ・E・ブランスウェイト、ザーラ・Z・ファラーバクシュ、スニグダ・ムケルジー、パトリック・R・メルギン、キートン・ソング、コーディ・A・シチリアーノ

米国マサチューセッツ州ボストン、ハーバード大学医学部神経生物学科

ハビバ・ノアマニー

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ARB と CAS が共同でこのプロジェクトを発案しました。 ARB、CAS、ZZF が実験を設計しました。 ARB、HEB、ZZF、SM、PRM、KS がデータを収集しました。 CAS と HN は MATLAB 解析コードを開発しました。 ARB、ZZF、CASで解析を行った。 ARB と CAS は図を作成し、論文を執筆しました。

コディ・A・シチリアーノへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ブラウン、アーカンソー州、ブランスウェイト、HE、ファラーバクシュ、ZZ 他基礎的およびトランスレーショナルアルコール研究のためのアルコール強化の構造化追跡（STAR）。モル精神医学 28、1585–1598 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41380-023-01994-4

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受信日: 2022 年 1 月 5 日

改訂日: 2023 年 1 月 26 日

受理日: 2023 年 2 月 7 日

公開日: 2023 年 2 月 27 日

発行日：2023年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-01994-4

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