スケーラブルな継続的

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6857 (2023) この記事を引用

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ウイルスベクターは、細胞治療薬の製造におけるボトルネックとなっています。 エレクトロポレーションは、初代細胞の非ウイルストランスフェクションのアプローチとして登場しましたが、標準的なキュベットベースのアプローチでは、スループットが低く、最適化が難しく、大規模な細胞製造との互換性がないという問題があります。 ここでは、研究およびプロセスの最適化のために少量の細胞を効率的にトランスフェクトし、細胞治療への応用に必要な量にスケールできる、迅速かつ再現性のあるエレクトロポレーションが可能な新しいエレクトロポレーション プラットフォームを紹介します。 当社は、コントロール細胞と比較して細胞生存率の損失が 2% 未満で、mRNA 送達のトランスフェクション効率が 95% 以上であるなど、高い効率と生存率でプラスミド DNA および mRNA を初代ヒト T 細胞に送達することを実証します。 2 億 5,600 万細胞/分の実験スループットを達成する送達をスケーリングする方法を紹介します。 最後に、CRISPR/Cas9 を使用して T 細胞受容体 (TCR) 発現をノックダウンする、治療に関連した初代 T 細胞の修飾を実証します。 この研究は、細胞製造のための T 細胞の効率的な非ウイルス操作に対する満たされていないニーズに対応する当社のシステムの機能を示しています。

細胞療法は、さまざまな遺伝性疾患や後天性疾患を治療できる可能性に対する熱意を生み出しています。 特に、キメラ抗原受容体（CAR）を発現するように改変された自己 T 細胞を利用する免疫療法は、特定の血液がんに対して、顕著な完全応答率と耐久性のある長期にわたる寛解を達成しています。 研究は固形腫瘍などの他のがんの治療に向けられています。 しかし、承認された第 1 世代の CAR-T 細胞療法は、細胞の再プログラミングのためにレンチウイルスやアデノ随伴ウイルス (AAV) などのウイルスベクターに依存しています 1、2、3、4、5。 ウイルスベクターは、トランスフェクションが難しい初代ヒト免疫細胞への高効率の形質導入を可能にしましたが、複雑で高価な製造プロセス、免疫原性、挿入突然変異誘発の可能性に関連するいくつかの欠点があります6、7、8。 さらに、この分野では、CRISPR/Cas9 テクノロジーによる複数の遺伝子編集やトランスポゾンエレメントによる遺伝子挿入など、ウイルスアプローチに関連する典型的なパッケージング制限と互換性のない、より複雑な再プログラミング方法に向かう傾向にあります9、10、11、12、13。

これらの制限を回避するために、研究努力はウイルス送達に代わる非ウイルストランスフェクション法にますます焦点を当てています9、14、15。 非ウイルストランスフェクション法の中でも、エレクトロポレーションは、DNA、RNA、タンパク質を細胞に送達するために一般的に使用されるよく研究されたアプローチであり、ウイルスベクターに代わる有力な候補として認識されています。 例えば、Bozza らは、エレクトロポレーションを使用して、ウイルスアプローチに関連する欠点の多くを回避する非統合型 DNA ナノベクターを使用して組換え T 細胞を生成できることを実証しました 8。 同様に、エレクトロポレーションは最近、ヨーロッパでのウイルスフリー CAR-T 細胞を用いた最初の臨床試験 16 および piggyBac システム 17 で、Sleeping Beauty トランスポゾン システムを使用して CAR-T 細胞を生成するために使用されました。

長年使用されてきた標準的な静的エレクトロポレーション法では、キュベット内の細胞懸濁液に高電圧の電気パルスを印加することによって電場が生成されます18。 印加された高電圧パルスにより、細胞膜に一時的な細孔が形成され、分子が細胞内に拡散できるようになります19、20。 ただし、過度の電界強度は不可逆的な細胞膜破壊と細胞死を引き起こす可能性があります。 標準的なプロセスでは、パルス電圧、パルス数、およびパルス持続時間は、分子挿入効率と細胞生存効率を最適化するために経験的に変更されるパラメーターです。 経験に基づく最適化は面倒な場合があり、電極に対するセルのランダムな位置などによりプロセスにばらつきが生じる可能性があります21。 さらに、標準的なキュベットスタイルのエレクトロポレーション法ではスループットが限られており、大規模または自動化された細胞製造と互換性がありません 22。 そのため、ウイルスベクターの使用に比べて潜在的な利点があることが理解されているにもかかわらず、分子導入の効率、細胞生存率、プロセスの変動性、および限られたスループットの制限により、この方法の広範な適用は制限されています。

ここでは、細胞治療への応用において、研究から臨床規模までシームレスに導入をスケールできる、迅速かつ再現性のあるエレクトロポレーションが可能な新しいマイクロ流体エレクトロポレーションプラットフォームについて説明します。 私たちのアプローチには、再現可能なエレクトロポレーションのために各セルが同じ電場にさらされることを保証する薄いスラブ形状の平面フローセルが組み込まれています。 特に、流れに垂直な水平方向のデバイスの幅は、細胞が経験する電場を変えることなく、所望の実験スループットに合わせて変更できます。 当社のプラットフォームを使用して、細胞生存率への影響を最小限に抑えながら、高効率で初代 T 細胞にプラスミド DNA と mRNA を送達することを実証します。 デバイスの幅や流量などのその他のパラメーターをスケールすることにより、少量の多重最適化を使用して特定されたトランスフェクション パラメーターが、細胞製造に必要な大規模トランスフェクションでどのように簡単に実装できるかを示します。 最後に、当社のプラットフォームを使用して初代 T 細胞の治療的修飾、つまり T 細胞受容体 (TCR) を標的とした CRISPR/Cas9 リボ核タンパク質 (RNP) 複合体の送達を実行します。 私たちのデータは、細胞製造のための T 細胞の効率的な非ウイルス操作に対する満たされていないニーズに対処する私たちのシステムの可能性を示しています。

当社のプラットフォームには、効率的かつ再現性のある細胞のエレクトロトランスフェクションが可能な使い捨ての連続フローマイクロ流体チャネルが組み込まれています。 マイクロ流体チャネルは、薄いスラブ形状の平面フロー チップで構成されます。 流れ方向に対して垂直に均一な電場を印加するために、上下の流れ面に電極がパターン化されています（図1A）。 電場には、連続的に周期する任意の電圧波形が印加されます。 チャンネルの高さが 80 µm と薄いため、各細胞が同じ電場と化学環境にさらされることが保証され、再現性のあるエレクトロポレーションが可能になります。 また、チャネルの高さが薄いため、高電圧に比べて比較的低い電圧振幅（約 1 ～ 8 V）を使用して、細胞膜の細孔を一時的に開くのに必要な電場強度（通常は 10 ～ 100 kV/m23 と推定される）を達成することができます。従来の商用システムの。 たとえば、チャネル高さが 80 μm の場合、10 V の印加電圧により、電界強度は 125 kV/m になります。 これらの比較的低い電圧振幅と、低導電率エレクトロポレーションバッファー、一定の流体流量、および電圧波形の連続サイクルとの組み合わせにより、エレクトロポレーションを妨げる可能性があるマイクロ流体チャネル内での加水分解による気泡形成の問題が回避されます。 これらの実験で使用されるデバイスの幅 (2 または 10 mm) は、チップを通る細胞の迅速かつ連続的な流れを可能にするために、その深さよりもはるかに大きくなっています (図 1B)。 重要なのは、デバイスの幅は 10 mm よりも大きく、細胞が経験する電場を変えることなく、所望の実験スループットに合わせて変更できることです。 そのため、当社の平面形状により、臨床規模の送達のために大きな容量とチャネル幅にスケールアップする前に、小さな容量とチャネル幅を使用して最適なトランスフェクション パラメーターを決定することができます。

CyteQuest エレクトロポレーション プラットフォームの概要。 エレクトロポレーション フローセルの (A) 側面図および (B) 上面図 (縮尺は一定ではありません)。 (C) マニホールド、チューブ、および 3 セットの独立してアドレス指定可能な電極が取り付けられた実験用フローセルの写真。 (D) エレクトロポレーション プラットフォームを構成するコンポーネントを示すブロック図。 (E) 周波数 f、持続時間 t、電圧振幅 V のバイポーラ方形波形を示すプロット。

当社のデバイスは、選択可能なコンピューター制御の電圧波形とロボットによる分画収集を使用した自動細胞処理アプローチと統合するように設計されています。 当社のプラットフォームは、任意の電気波形を配信できます。 通常の操作中、細胞はシリンジ ポンプによって 1 つの流体入口を通ってチャネルに送られ、1 つの流体出口から排出されます (図 1C)。 通常、細胞は、送達されるカーゴを含む低伝導率のエレクトロポレーションバッファーに懸濁されます。 エレクトロトランスフェクションを最適化するために、カスタム MATLAB スクリプトは、事前にプログラムされた電気波形を含む関数発生器を制御し、ロボット オートサンプラーは、マルチウェル プレートに分注するために出口チューブを移動するようにプログラムされています (図 1D)。 細胞に印加される電気波形を迅速に変更するために、フローセルは電極ペアの下流の容積が最小限（約 11 µL）になるように設計されています。 この下流の容積は、出口チューブ (約 6 μL) とフロー チャネル (約 5 μL) に分割されます。 したがって、事前にプログラムされた電気波形が交換されると、出口チューブから出る細胞はほぼ瞬時に新しい波形を受信した細胞を表します。 波形の交換中にロボット オートサンプラーをウェルに浸すタイミングを調整することで、各ウェルの純度を確実に高めることができます。 印加電圧条件の遷移によって導入される混合サンプル条件の期間は、ウェルあたりの比較的長い滞留時間 (10 秒) によって薄められます。これは、スワッピング速度 (約 2 秒) の 5 倍です。 そのため、当社のプラットフォームはトランスフェクションの電気パラメーターを迅速かつ簡単に最適化できます。 この研究では、周波数 (f)、持続時間 (t)、電圧振幅 (V) によって記述できるバイポーラ方形波形の使用に焦点を当てます (図 1E)。 全体として、このロボットセットアップにより、電気パラメーターを迅速にスイープして、トランスフェクションに望ましい条件を選択することができます。 次に、選択した電気条件を使用して大規模なトランスフェクションを実行します。

波形がセルに適用されると、カスタム MATLAB スクリプトはオシロスコープも制御して電圧波形を監視します。 フロー チップと直列の 1Ω 抵抗の両端で降下する電圧を測定することにより、電流を測定します。 幅 2 mm のチップにおける時間の関数としての電圧と電流の代表的なプロットを図 2 に示します。電圧が印加される 100 μs の間隔で電流がわずかに減衰するため、いくつかの無効要素が存在します。 平均電流は、23 V の電圧で約 7 mA です。 オームの法則 \(\overrightarrow{J}=\sigma \overrightarrow{E}\) を使用して、電極間の領域内の電場 \(\overrightarrow{E}\) を計算します。ここで、 \(\overrightarrow{ J}\) は (電極の) 単位面積あたりの電流、\(\sigma\) はバッファーの導電率です。 導電率の測定値 (9 × 10-3 S/m) と電極の寸法を使用すると、電場は約 278 kV/m であることがわかります。 これは、電極が導体で分離された平行板を構成すると仮定した単純な推定とよく一致します。この場合、電界強度は印加電圧をチャネル高さ 80 ミクロンで割ったものになります。 この推定値は、電極表面に蓄積するイオンによる容量効果を無視しています。 ただし、23 V の印加電圧の場合、このモデルでは 288 kV/m の電界が推定されます。

オシロスコープで測定された時間変化する電圧と電流を表示する、時間平均されたオシロスコープのトレース。 (A) f = 66 Hz、V = 23 V、t = 100 μs のバイポーラ方形波形の電圧チャネルの複数サイクル。 点線のボックスは、波形のズームされた時間領域を示し、対応する (B) チャネル間の電圧と (C) チャネルを流れる電流を示します。 時間平均化: 64 トレース。

mRNA を送達する当社のプラットフォームの機能を実証するために、GFP をコードする mRNA を Jurkat 細胞と初代 T 細胞にトランスフェクトしました。 CD3/CD28 抗体による活性化の 4 日後に、健康なドナーからの初代 T 細胞をトランスフェクトしました。 両方の細胞タイプを、20 μg/mL または 40 μg/mL の GFP コード mRNA を含む低伝導率エレクトロポレーション バッファーに 5 × 106 細胞/mL の濃度で再懸濁し、シリンジにロードし、エレクトロポレーション フロー セルに流し込みました。私たちの方法で説明されています。 細胞が電極の下を通過するとき、電場（t = 100 μs、f = 100 Hz）を通過する時間中に細胞が平均して 3 つの双極方形波形（図 1E）を受信するように波形周波数が選択されました。 この値は、平均線速度、体積流量、および流れ方向に沿った電極の寸法から推定されました。 対照として、細胞を印加電圧ゼロで収集した。

送達パフォーマンスを測定するために、トランスフェクションの 24 時間後にフローサイトメトリーを使用して細胞を分析しました (図 3A、B)。 各電圧条件について、細胞数、生存率、および GFP 発現は、方法で説明されているように連続的なゲートを通じて直接測定されました。 各電圧条件の生存率は、生存率色素 (7-AAD) を使用して測定した生存細胞数 (Nviable) を、トランスフェクションの 24 時間後に測定したその電圧条件での総細胞数 (Ntotal) で割って計算しました。 。

GFP をコードする mRNA の Jurkat 細胞および初代 T 細胞への送達。 (A) 細胞形態、生存率、および GFP 発現を示す、ゼロ電圧制御または (B) エレクトロポレーションされた Jurkat 細胞からの代表的なフローサイトメトリー プロット。 (C) 20 または 40 µg/mL mRNA を使用した Jurkat 細胞への送達に対する波形電圧振幅の変化の影響 (n = 3)。 (D) 4 人の健康なドナー (n = 4) からの初代 T 細胞に対して 40 μg/mL mRNA を使用した高効率送達。 データは平均値 ± 標準偏差 (C、D) として表示されます。 一部の誤差バーは小さすぎて見えません (C)。

初代 T 細胞の場合、エレクトロポレーションとは関係なく、各 T 細胞ドナーの初期生存率が 83 ～ 92% の範囲であったため、生存率が計算されました。 生存率は、生存率（式1）をゼロ電圧制御セルの生存率で割ったもの（生存率ゼロ電圧制御）として計算されました。

ゼロ電圧コントロール細胞の生存率は、電場を印加せずにデバイスを通過した細胞からトランスフェクションの 24 時間後に測定されます。 GFP 発現は、生存細胞数と発現細胞数 (Nexpressing) を生存細胞数で割ったものとして定義されました。

生存率の測定ではエレクトロポレーション中に失われた細胞（つまり、完全な溶解）が考慮されていないため、各電圧条件での細胞の総数（Ntotal）をゼロ電圧コントロール細胞の数で割ったものとして相対収量も計算しました。 （ゼロ電圧制御）。

相対収量はトランスフェクション後 24 時間の細胞数から測定されるため、この測定は細胞播種の変動、増殖速度の変動、エレクトロポレーション中の細胞溶解または損失の影響を受けます。

GFP をコードする 20 または 40 μg/mL の mRNA と 3 ～ 11 V の範囲の波形電圧振幅を使用して、Jurkat 細胞への mRNA の送達をテストしました (図 3C)。 波形の電圧振幅が増加するにつれて、GFP 発現が 5 V 以下では存在せず、11 V で約 97% のプラトー値に達するまで増加する閾値効果が観察されました。テストしたすべての電圧振幅と mRNA 濃度において、生存率は相対的に変化しませんでした。相対収率は > 90% のままでありながら、ゼロ電圧制御まで変化しました (図 3C、図 S1A)。 注目すべきことに、4人の健康なドナーに由来する初代T細胞からは95％±1.8％のGFP発現が観察され、生存率と相対収率はそれぞれ98％±1.4％と92％±6.6％でした（図3D、図S1B）。 。 GFPをコードするmRNAを発現する初代T細胞の代表的な顕微鏡画像を図S2に示します。 したがって、これらのデータは、細胞の生存率に影響を与えることなく、高効率で mRNA を送達する当社のプラットフォームの能力を実証しています。

マイクロ流体システムとの比較として、キュベットベースのエレクトロポレーション システムである Bio-Rad の Gene Pulser を使用して、GFP をコードする mRNA (40 μg/mL) を初代 T 細胞にトランスフェクトしました。 初代T細胞は、細胞が低伝導率バッファーではなくジーンパルサーエレクトロポレーションバッファーに懸濁されたことを除いて、我々のシステムと同様に培養および調製されました。 生存率91±10％で83±9％のGFP発現が観察されました（補足図S3）。 これらは、同じ mRNA 構築物でトランスフェクトされた初代 T 細胞からの最大 81% の GFP 発現と 91% の生存率を報告する Bio-Rad によって報告された値と同様です (1)。 当社のプラットフォームが GFP 発現と生存率の両方でより高い値を提供することを考えると、これらの結果は、当社のプラットフォームが mRNA 送達に関して Gene Pulser キュベット システムよりも優れていることを示しています。

現在の自己細胞治療には大量の人工細胞が必要であることを考慮して 24、細胞処理スループットを向上させるために当社のプラットフォームで簡単に利用できる 3 つの方法を検討しました: (1) 流路の幅と体積流量を比例的に増加させる、(2) 流体流量を比例的に増加させる速度と波形周波数、および (3) エレクトロポレーション バッファー内の細胞濃度を増加します。

体積流量とチャネル幅を同じ倍率で増加しても、電極下のセルの平均線流速は変化しないため、セルの電気的または化学的環境に影響を与えません。 チャネルの幅を最適化研究で使用した 2 mm から 10 mm に増加させ、同時に体積流量を 320 μL/min から 1.6 mL/min に比例的に増加させました (図 4A、B)。 ジャーカット細胞は、記載されているように 5 × 106 細胞/mL の濃度で双極方形波形 (t = 100 μs、f = 100 Hz、V = 13 V) を使用して、両方のチャネルで GFP (20 μg/mL) をコードする mRNA でエレクトロポレーションされました。以前。 注目すべきことに、GFP 発現、生存率、および相対収量は 2 mm チャネルと 10 mm チャネルでほぼ同一でしたが、細胞処理スループットは 1.6 × 106 細胞/分から 8 × 106 細胞/分へと 5 倍増加しました (図 4C、図 S4A)。 ）。 これらの結果は、フローセルのチャネル幅と体積流量を比例的に増加させることで、セル処理スループットをシームレスに増加させる簡単な方法が得られることを示しています。

臨床規模の量の細胞処理スループットを向上します。 (A) 2 mm および (B) 10 mm エレクトロポレーション フローセルの写真。 赤い矢印はチャネル幅を強調表示します。 (C) 2 mm または 10 mm チャネルのいずれかで GFP をコードする mRNA をトランスフェクトした Jurkat 細胞からの GFP 発現および生存率の値のプロット (n = 3)。 (D) エレクトロポレーションバッファー中のさまざまな細胞濃度で 2 mm チャネル内の GFP をコードする mRNA をトランスフェクトした Jurkat 細胞からの GFP 発現および生存率の値のプロット (n = 3)。 (E) さまざまな流速と波形周波数での 10 mm チャネル内の GFP をコードする mRNA をトランスフェクトした Jurkat 細胞からの GFP 発現と生存率の値のプロット (n = 3)。 (F) 56 秒間で約 2 億 4,000 万個の細胞をトランスフェクトした実験からの GFP 発現と生存率の経時的なプロット (n = 1)。 データは平均値 ± 標準偏差 (C–E) として表示されます。 一部の誤差バーは小さすぎて見えません (C ～ E)。

細胞処理スループットを向上させる方法として、エレクトロポレーションバッファー内の細胞濃度を増加させることをテストしました。 前述のように、双極矩形波 (t = 100 μs、V = 13 V、f = 100 Hz) を使用して、GFP (20 μg/mL) をコードする mRNA を Jurkat 細胞にエレクトロポレーションしました。 5、10、または20×106細胞/mLの濃度でトランスフェクト細胞をテストしましたが、GFP発現、生存率、または相対収量に違いは観察されませんでした（図4D、図S4B）。 したがって、トランスフェクション中の細胞濃度を高めることにより、細胞処理のスループットを向上させる別の簡単な方法が提供されます。

チャネル幅または細胞濃度を増加させることに加えて、体積流量と電気波形周波数も比例して増加させて、スループットを向上させました。 Jurkat 細胞は、前述のように 5 × 106 細胞/mL の濃度で双極矩形波形 (t = 100 μs、V = 13 V) を使用して GFP (20 μg/mL) をコードする mRNA でエレクトロポレーションされました。 体積流量を 1.6 mL/min から 12.8 mL/min に比例的に増加させて、波形周波数を 100 Hz から 800 Hz に増加させることをテストしました。 GFP 発現、生存率、または相対収量に違いは観察されませんでした (図 4E、図 S4C)。 重要なのは、波形周波数と流量を比例的に増加させると、セル スループットが 8 × 106 セル/分から 64 × 106 セル/分に増加したことです。 したがって、この方法では、フロー チャネルの形状を変更することなく、細胞処理のスループットを大幅に向上させることができます。

最後に、臨床スケールのトランスフェクションのデモンストレーションで、GFP をコードする mRNA を約 2 億 4,000 万の Jurkat 細胞に効率的に送達するために、単一の実験で細胞処理スループットを向上させる前述のすべての方法を組み合わせました。 Jurkat 細胞に、双極方形波 (t = 100 μs、V = 13 V、f = 800 Hz) を使用して 20 × 106 細胞/mL の濃度で 12.8 mL/min で流しながら mRNA (20 μg/mL) をトランスフェクトしました。 。 2 億 5,600 万細胞/分の処理速度で、2 億 4,000 万細胞への配信には約 56 秒かかりました。 送達中のさまざまな時点で細胞をサンプリングしたところ、GFP 発現と生存率はそれぞれ 97 ± 0.12% と 96 ± 0.39% で経時的に安定していることがわかりました (図 4F)。 相対収率は 73% ± 5% でよりばらつきがありました。 全体として、細胞処理スループットを向上させるために当社のプラットフォームで利用できるさまざまな方法により、臨床規模の送達に必要な速度で高効率な送達が提供されます。

プラスミド DNA の送達を実証するために、固定期間 (t = 100 μs) の双極方形波形を使用し、Jurkat 細胞と初代汎 T 細胞の両方で 3 つのパラメーターを変化させる影響をテストしました: 波形電圧振幅 (V)、波形周波数 (f) )、およびプラスミド濃度。

Jurkat 細胞と初代汎 T 細胞は前述のように調製されました。 Jurkat細胞と初代T細胞の両方で、GFPをコードするプラスミドDNAの濃度を増加させると、GFP発現が増加し、生存率が減少し、相対収量が減少しました（図5A、C、図S5A、B）。 GFPをコードするプラスミドDNAを発現する初代T細胞の代表的な顕微鏡画像を図S6に示します。 興味深いことに、プラスミド濃度を増加すると、プラスミド濃度が増加するにつれて効果は減少し、GFP 発現の増加は小さくなりました。 同様に、波形周波数を増加させると、GFP発現も増加し、生存率と相対収量が減少する一方で、収益は大幅に減少しました（図5B、D、図S5C、D）。 電極下での通過時間あたり平均 1 (33 Hz)、2 (66 Hz)、または 3 (100 Hz) の波形を受信する細胞に対応する 3 つの波形周波数値をテストしました。 体積流量はすべての場合において一定に保たれた。 一般に、GFP 発現は 33 Hz から 66 Hz で大幅に増加しましたが、66 Hz から 100 Hz ではそれ以上の増加はほとんどありませんでした。 Jurkat 細胞は、3 回の独立した実験にわたって再現性のあるパフォーマンスを示し、標準偏差値は GFP 発現で 1 ～ 4%、生存率で 1 ～ 5% の範囲でした。 初代T細胞は、ドナー間の有意な変動を示しました（図S7、S8）。 全体として、3 つのパラメーターを変更することで、両方の細胞タイプの広い範囲の値内でプラスミドの発現と生存率を調整できました。

GFP をコードするプラスミド DNA を Jurkat および初代 T 細胞に送達するためのさまざまなトランスフェクション パラメーターの結果。 (A) プラスミド DNA を Jurkat 細胞に送達するための、さまざまなプラスミド濃度または (B) 波形周波数の影響。 (C) プラスミド DNA を初代 T 細胞に送達するための、さまざまなプラスミド濃度または (D) 波形周波数の影響。 データは平均±標準偏差として示されます。 n = 3 (A、B)。 データは代表的なドナーからの値として示されています。 n = 1 (C、D)。 一部のエラーバーは小さすぎて Jurkat セル (A、B) では表示できません。

マイクロ流体システムとの比較として、Gene Pulser キュベット システムを使用して、GFP (75 μg/mL) をコードするプラスミド DNA を初代 T 細胞にトランスフェクトしました。 Gene Pulser でプラスミド DNA をトランスフェクトした初代 T 細胞は、62 ± 15% の GFP 発現と 70 ± 19% の生存率を示しました (補足図 S3)。 私たちのシステムでは、最も類似した分娩条件で、65 ± 7% の GFP 発現と 70 ± 9% の生存率が報告されています (f = 33 Hz、V = 29 V、t = 100 μs)。 GFP 発現と生存率の平均値が同様であることは、プラスミド DNA 送達のパフォーマンスが同様であることを示唆しています。 ただし、当社のマイクロ流体プラットフォームでは、標準偏差の値が低くなります。これは、フロー チップの薄いスラブ形状に固有の均一な電場によるものと考えられます。 GFP 発現と生存率の標準偏差値が低いことは、当社のマイクロ流体プラットフォームによる明確な利点をもたらします。

当社のプラットフォームの柔軟性を実証するために、任意の波形を使用して GFP をコードするプラスミド DNA を Jurkat 細胞に送達しました。 我々は、細孔の核形成と考えられる持続時間の短い高振幅セグメント (V1、t1) と、それに続く細孔を成長させて電気泳動で駆動すると考えられる持続時間の長い低振幅セグメント (V2、t2) を特徴とするデュアルレベル波形を選択しました。 DNA などのカーゴを細胞に充填します 25,26 (図 6A)。 デュアルレベル波形はプラスミド DNA 発現と細胞生存率のバランスを有利に保つことがいくつかのグループによって発見されています。 これらのレポートに動機付けられ、システムの機能を実証するために、f = 66 Hz、V1 = 21 V、および t1 = 75 μs を選択し、より長時間の低振幅セグメントの V2 または t2 を変化させる影響を測定しました。 (図6A)。

任意の電気波形の配信。 (A) 短期間の高振幅セグメント (V1、t1) とその後に続く長期間の低振幅セグメント (V2、t2) を特徴とするバイポーラのデュアル電圧波形を示すプロット (B) 変動する V2 の影響一方、t2 = 250 μs (n = 3)。 (C) V2 = 4 V の場合の t2 の変化の影響 (n = 3)。 (B) と (C) の両方で、f = 66 Hz、V1 = 21 V、および t1 = 75 μs に固定します。 データは平均値 ± 標準偏差 (B、C) として表示されます。 一部の誤差バーは小さすぎて見えません (B、C)。

Jurkat 細胞は前述のように調製されました。 トランスフェクションの効率は、GFP 発現と生存率の積として定義され、波形パフォーマンスを比較するための単一の指標として計算されました。 V2 または t2 のいずれかが増加すると、GFP 発現は増加しましたが、生存率と相対収量は減少しました (図 6B、C、図 S9)。 特に、波形性能、効率に関する本発明の測定基準は、Ｖ２の中間値でピーク値を示し、デュアル電圧レベル波形がどのようにしてＧＦＰ発現と生存率とのバランスを良好にできるかを示している。 全体として、これらのデータは、任意の電圧波形を提供する当社のプラットフォームの機能と、この機能がプラスミド DNA のエレクトロポレーション性能の向上にどのような利点をもたらすかを示しています。

GFP を超えて貨物を配送する能力を実証するために、次に CRISPR-Cas9 システムに目を向けました。 TCR発現のノックアウトは、同種異系CAR T細胞を操作するための移植片対宿主病（GVHD）回避の方法として研究されているため、TCRのα鎖およびβ鎖をコードするTRACおよびTRBC遺伝子座を標的とすることを選択した14。 健康なドナーからの初代 T 細胞を、CD3/CD28 抗体による活性化の 4 日後に、双極方形波形 (t = 100 μs、f = 100 Hz、V = 5 ～ 29 V) および CRISPR-Cas9 RNP (1 μM) を使用してトランスフェクトしました。 。 TCR発現、生存率、および相対収量は、トランスフェクションの72時間後に、抗ヒトTCR抗体およびフローサイトメトリーを使用して測定されました。 波形電圧振幅が増加するにつれて、TCR 発現は 89 ± 1.0% から 7.4 ± 1.0% に急激に低下しました (図 7)。 生存率も電圧の増加とともに減少し、25 V までは最小限の変化で、12 ± 2.1% の TCR 発現と 88 ± 1.0% の生存率が得られました。 25 V 後、生存率は急激に低下しました。 次に、トランスフェクション後 7 日間にわたるコントロール (0 V) 細胞とエレクトロポレーション細胞 (25 V および 29 V) の増殖能力を測定しました (図 S10)。 ゼロ電圧のコントロール T 細胞は急速に増殖し、7 日間の観察期間中に複数回の集団倍加を経験しました。 25 V 波形でエレクトロポレーションされた T 細胞は、エレクトロポレーション後 2 日間、対照細胞と比較して低い増殖速度を示しました。 この回復期間の後、25 V 波形を受けた細胞は対照細胞と同じ速度で増殖しました。 より高い波形振幅を受け取った T 細胞は、より低い増殖能力を示しました。 これらの結果は、非常に高いトランスフェクション効率と細胞の健康の間のトレードオフを示しています。 全体として、これらのデータは、当社のプラットフォームが、現在承認されている自己細胞療法を超えて細胞療法を進歩させるための有望な技術である CRISPR/Cas9 遺伝子操作を実行する能力を備えていることを示唆しています。

TRAC/TRBC を標的とする CRISPR/Cas9 RNP の送達。 TRAC/TRBC を標的とする CRISPR/Cas9 RNP を初代 T 細胞にトランスフェクトしてから 72 時間後に測定された、印加電圧振幅の関数としての TCR 発現、生存率、または相対収量のプロット (n = 3)。 データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。 一部のエラーバーは小さすぎて見えません。

エレクトロポレーションは、細胞治療薬を製造するためのウイルスベースの方法に代わる有望なアプローチですが、従来のキュベットスタイルの方法は、プロセスの変動性、困難な最適化、および低いスループットによって依然として制限されています。 ここでは、自動実験と組み合わせた平面フローセルの組み込みにより、これらの制限を回避する新しいエレクトロポレーション プラットフォームを紹介します。 私たちのパフォーマンスデータが示すように、さまざまな分子カーゴを細胞に効率的に送達するための条件を導き出すために、大きなパラメーター空間を迅速に探索できます。 重要なのは、少量を使用して実行された最適化が細胞製造の大規模トランスフェクションにどのように直接変換できるかを実証したことです。 これらの革新を総合すると、当社のプラットフォームが細胞製造用の T 細胞の非ウイルス操作に対する満たされていないニーズに対応できる可能性があることが実証されています。

私たちは、細胞生存率やデバイスからの相対収量に大きな影響を与えることなく、GFP をコードする mRNA を Jurkat および初代 T 細胞に高効率で送達することを観察しました (Jurkat では > 98%、初代 T 細胞では > 95%)。 当社の mRNA 送達パフォーマンスは、キュベット スタイルのエレクトロポレーション デバイスから報告された値を上回り、他のマイクロ流体、非ウイルス性トランスフェクション アプローチのパフォーマンス指標を満たすか、それを上回っています 27、28、29、30。 Gene Pulser システムを使用したトランスフェクションを含む他のアプローチとの比較では、細胞の調製、細胞および/またはカーゴの濃度、エレクトロポレーションバッファーの選択など、実験条件によってトランスフェクションのパフォーマンスが大幅に変化する可能性があることに注意することが重要です31、32、33。 重要なのは、エレクトロポレーションバッファー内の細胞の濃度、チャネルの幅、流量、波形周波数を増加させることで、mRNA 送達をシームレスにスケールすることができたことです。 これらのスケーリング方法を組み合わせることで、10 mm のチャネル幅を使用してスループットを 2 億 5,600 万セル/分まで高めることができました。この幅はさらに拡張可能です。 全体として、我々の結果は、チャネルの幅を増やし、実証された流れ、化学的、電気的条件を使用することで、多くの場合10億個を超える細胞を必要とする細胞治療に必要な細胞量を満たすことができることを示しています14、34、35。

現在の自己 T 細胞療法は、長期間と費用のかかる製造を必要とするため、大規模な臨床使用が制限されています 14。 健康なドナーからの汎用の「既製」CAR-T 細胞または同種異系 CAR-T 細胞はこれらの制限を回避できる可能性がありますが、同種異系 CAR-T 細胞は宿主の免疫系によってすぐに排除される可能性があり、生命を脅かす移植片対宿主病を引き起こす可能性もあります ( GVHD)35,36。 TCR-α (TRAC) および TCR-β (TRBC) をコードする遺伝子の破壊は、GVHD のリスクを軽減する方法として他の場所で報告されており、現在、前臨床研究および臨床試験で研究されています 36、37、38、39。 ここでは、TCR の一次 T 細胞発現を効率的にノックアウトするための CRISPR-Cas9 RNP の送達を実証し、次世代の同種異系 CAR-T 細胞の製造に私たちのデバイスがどのように使用できるかを示します。

当社のフローセルの薄いスラブ形状と平行平板電極は、(1) 各セルを同じ電界にさらす機能、(2) 必要なスループットに合わせて拡張できる機能など、当社のプラットフォームの多くの強みを提供する革新的な技術です。最小限の労力。 これらの革新は、マイクロ流体の非ウイルス性トランスフェクションデバイスを開発する他のアプローチと私たちのアプローチを区別します。 チャネルの高さが薄い (80 μm) ため、空間的に均一な電場を持つ平行プレート形状が形成され、再現性の高いエレクトロポレーションが得られます。 当社では、GFP 発現および生存率の標準偏差が 5% 未満であることを日常的に報告しています。 さらに、チャネルの高さが薄いため、従来の商用システムや他のマイクロ流体エレクトロポレーションデバイスと比較して、比較的低い電圧振幅（約 1 ～ 8 V）でエレクトロポレーションに必要な電場強度（通常は約 10 ～ 100 kV/m）に達することができます28。 たとえば、mRNA 発現は 5 V の電圧振幅で始まり、11 V 付近で頭打ちになることが観察されました。そのため、私たちのデバイスは高電圧の使用を回避できます。 また、我々の装置には、Lissandrello et al.28 が採用したマルチフロー システムなどのより複雑なアプローチとは対照的な、単純な単一流体フロー システムが組み込まれています。

フローチップの平面構造は、流れに垂直な幅の狭い寸法と広い寸法の比率が 10% 未満であり、セルの電気的環境に影響を与えることなく幅と流量を増加できるという点で重要な役割を果たします。 円形の断面を持つマイクロ流体デバイス、または幅と高さの比が約 1 であるマイクロ流体デバイスでは、流速はチャネル全体で放物線状になり、その中心で最大値になります。 Brody et al. で議論されているように、幅の狭い寸法と広い寸法の比率が 10% 未満になると、長方形の流路内の速度プロファイルは広い寸法に沿って「プラグ形状」になります 40。 このプラグ形状のプロファイルは、チャネルの高さに匹敵する距離にわたってエッジで速度がゼロに変化するまで一定です。 このプラグ形状の速度プロファイルは、狭いアスペクト比と広いアスペクト比が小さい長方形のフローセルにおけるいわゆるヘレ・ショー流のよく知られた特徴です。 これは、ここで説明するフローセル内でセルが電場にさらされる時間が、フローセルの幅に沿ったどの位置でも本質的に一定であることを意味します（詳しく説明したエッジ付近を除く）。 幅と体積流量を比例的に増加させることによって前記装置のスループットを増加させても、この特徴は依然として有効である。 垂直方向の流速プロファイルは放物線状です。 ただし、セルのサイズはチャネルの高さの無視できない部分であるため、垂直方向の流速の分散は小さな粒子の分散よりも小さくなります。 重要なのは、垂直方向の流速の放物線プロファイルは、前述の広い次元でのヘレ・ショー流による幅と体積流量を比例的に増加させることでスループットを拡大する能力に影響を与えないことです。 したがって、低サンプルデバイスで最適化されたエレクトロポレーションパラメータは、幅と流量が増加したデバイスでも変化しません。

ここでは、チャネル幅が異なる 2 つの異なるフローセル (2 mm チャネルと 10 mm チャネル) 間のトランスフェクション性能を比較することにより、スケーリング機能を実証しました。 チャネル幅と流量を 5 倍に増やすと、同一の電気波形を使用した同一の性能で実験スループットが 5 倍に増加しました。 少量の細胞と試薬を使用してトランスフェクションパラメータを決定し、大量の臨床規模の送達のために最適化されたパラメータを直接変換できるこの機能は、当社のプラットフォームの重要な利点です。 特に、初代T細胞の非ウイルストランスフェクションが可能な連続フロープラットフォームは他にも複数ありますが、可変幅の薄いスラブ形状に固有のシームレスなスケーリング機能を提供するプラットフォームはありません。 たとえば、メカノポレーションアプローチは、細胞膜を一時的に開く物理的な収縮を通じて送達を達成します41、42。 ただし、流量とチャネルの寸法がトランスフェクション パラメーターに影響するため、スケールアップには並列化が必要です。

多くのグループが初代 T 細胞への mRNA カーゴの送達を実証するマイクロ流体の非ウイルスアプローチを開発していますが、プラスミド DNA を使用したそのパフォーマンスに関するデータは比較的少ないです 28、29、30。 ここでは、Jurkat 細胞と初代 T 細胞の両方への効率的なプラスミド DNA 送達を実証します。 mRNA 送達と比較して、GFP をコードするプラスミド DNA の効率的な送達には約 2 倍の電場強度が必要であり、トランスフェクション効率、生存率、および相対収量の値は低くなります。 プラスミド DNA の送達の難しさについてはおそらく複数の説明があり、DNA 電気伝達の正確な輸送機構はまだよく理解されていません 43,44。 mRNA の送達の相対的な容易さは、発現のために DNA が核に入る必要性と、プラスミド DNA カーゴ (約 3.7 kB) に比べて mRNA カーゴのサイズが比較的小さい (約 1 kB) ことに影響されると考えられます。 プラスミドサイズの増加は、トランスフェクション効率と生存率に悪影響を与えることが以前に報告されています45。 さらに、プラスミド DNA には、アポトーシスを引き起こす可能性がある非メチル化 CpG モチーフなどの病原体関連分子パターンがあります 46。 CpG モチーフに関連する細胞毒性は、電気波形パラメーターとは無関係に、プラスミド DNA 濃度の増加により細胞生存率が低下するという我々の観察を説明できる可能性があります。 エレクトロポレーションバッファー内でプラスミド DNA 濃度が増加すると、プラスミドのエレクトロトランスファーの増加を示唆する明るい GFP 発現が観察されました (データは示さず)。これは、電気波形パラメータとは無関係に細胞生存率の低下を説明できる可能性もあります。 プラスミド DNA を T 細胞に効率的に送達するために、DNA ナノベクター プラットフォームは、不要な DNA 配列を除去してプラスミド サイズを縮小すると同時に、ベクター内の CpG 配列を枯渇させて病原体関連分子パターンを除去することで毒性を軽減する可能性があります 8,46。

任意の時間変化する電界を供給できるため、パフォーマンスを最適化するためのほぼ無制限のパラメーター空間が提供されます。 双極波形を利用して、電極で発生する電気化学反応の影響を制限し、電極での電荷の蓄積を制限しました。 波形設計の柔軟性により、特定の貨物への配送を調整することができます。 例えば、電気泳動による転写がプラスミド DNA の送達に寄与し、送達性能を向上させるために二重電圧を備えた波形の出現につながったという証拠があります 23,25,26,47。 実際、我々は、二重電圧波形がプラスミド DNA の Jurkat 細胞への送達効率を向上させることができることを実証します。 また、電圧波形の振幅と波形周波数を変化させた場合の影響、つまり流れるセルが経験する波形サイクル数も評価しました。 プラスミド濃度、細胞濃度、およびその他のプロセスパラメータも変化させました。 カーゴ濃度の増加または電圧波形振幅の増加は、トランスフェクション効率を増加させ、生存率を低下させる傾向がありました。 これらの結果は、プラスミド DNA のトランスフェクション効率と生存率の間のトレードオフを記録した数多くの以前の研究と一致しています 48,49。

要約すると、我々の結果は、複数のカーゴを Jurkat および初代 T 細胞に高効率かつ高生存率で送達するための新しいエレクトロポレーション プラットフォームの機能を示しています。 当社のマイクロ流体プラットフォームによってもたらされる革新とその優れた性能により、このプラットフォームは細胞治療のための非ウイルス細胞再プログラミングのための有望なシステムとなっています。

エレクトロポレーション フロー チップは、ポリマー基板の 3 層スタックから構築されました。 3 つの層はすべて、小さなビーム スポット、高解像度の CO2 レーザーを使用してレーザー カットされました。 厚さ 1 mm のアクリル スラブ (米国ニュージャージー州ロビンズビルの McMaster Carr) から切り取られた上部層と下部層が、床とシール チャネルの表面を作成します。 中間層は、チャネルの深さと幅を定義するスペーサーであり、親水性の薄い感圧接着テープで構成されていました。 スペーサーの親水性により水性溶液が引き寄せられ、マイクロ流体チャネルの充填中に空気が閉じ込められることがなくなりました。 チップを製造するために、底部と上部のアクリル層をレーザーで 1 インチ × 2 インチの断片に切断しました。 次に、これらの部品をレーザーカットして、組み立てプロセス中に使用する流体入口/出口ポートと位置合わせ穴を追加しました。 各アクリル片は水で洗浄し、次にイソプロピルアルコールで洗浄しました。 その後、コーネル ナノスケール施設 (CNF) でマスクを使用し、CVC SC4500 電子銃蒸着システムを使用した物理蒸着によって、薄いチタン接着層と金の薄膜電極が各アクリル片の内面に蒸着されました。 中間層は形状に合わせて切断され、レーザー切断プロセスによって対応する位置合わせ穴も取り付けられました。 幅 10 mm のチャネルを充填する際の気泡を避けるために、チャネルは流体入口ポートと流体出口ポートでフレア状のテーパー形状になるように設計されました。 次に、3 ピース (アクリル、ポリマーフィルム、アクリル) サンドイッチアセンブリをプレスで圧縮結合しました。

初代 T 細胞は、ネガティブ免疫磁気分離を使用して正常なドナーから汎 T 細胞を単離した StemCell Technologies から購入しました。 初代 T 細胞は、100 μg/mL の組換えヒト IL-2 を添加した動物由来物質を含まない ImmunoCult 培地 (StemCell、カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー) で培養しました。 初代T細胞を解凍し、培地中で一晩放置し、その後、製造業者の指示に従ってCD3/CD28抗体(StemCell)で活性化した。 活性化の 4 日後、トランスフェクションのために細胞を収集しました。 Jurkat 細胞は Millipore Sigma (Millipore Sigma、米国マサチューセッツ州バーリントン) から購入し、10% ウシ胎児血清を補充した RPMI 1640 培地 (R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、米国) で培養しました。 すべての細胞は 37 °C、5% CO2 で維持されました。

pCMV-GFP (プラスミド DNA; 3705 bp) は、Altogen Biosystems (米国ネバダ州ラスベガス) から購入しました。 Dasher GFP mRNA (1 kb) は Aldevron から購入しました。 TRAC または TRBC 遺伝子座を標的とする SpCas9 および sgRNA (TRAC: 5'-AGAGUCUCUCAGCUGGUACA-3'; TRBC: 5'-GGAGAATGACGAGTGGACCC-3') は、Integrated DNA Technologies (米国アイオワ州コーラルビル) から購入しました。 リボ核タンパク質（RNP）複合体は、等モル量のSpCas9と各sgRNAを混合し、エレクトロポレーションバッファー中の細胞懸濁液に添加する前に室温で10分間インキュベートすることによって形成されました。

エレクトロポレーション実験では、細胞を収集し、計数し、BTXpress Cytoporation 低導電率エレクトロポレーションバッファー (導電率: 9 × 10-3 S/m、ホリストン、マサチューセッツ州、米国) で 2 回洗浄しました。 2 回目の洗浄後、特に記載がない限り、細胞を同じエレクトロポレーションバッファーに 5 × 106 細胞/mL の密度で再懸濁しました。 その後、配送される貨物を各実験に示された濃度で添加しました。 次に、細胞とカーゴを含む水溶液をシリンジに充填し、それをシリンジポンプ（Chemyx、スタッフォード、テキサス州、米国）に充填した。 特に明記しない限り、細胞懸濁液を 320 μL/分 (2 mm チャネル幅) または 1600 μL/分 (10 mm チャネル幅) でフローセルに連続的に流し込みました。 細胞が電極の下を通過する際、細胞は関数発生器 (Siglent SDG 1032X; Siglent, Technologies, Solon, OH, USA) によって生成され、RF アンプ (TS250; Accel Instruments, Irvine,カリフォルニア州、米国)。 細胞が出口から出ると、特注のロボットフラクションコレクターによって、あらかじめ温められた細胞培地を含むウェルに分注されます。 細胞が電極の下を通過するときに経験する波形の数は、次のように計算されます。

一方、セルの線速度は次のように計算されます。

各実験を通じて、関数発生器とオシロスコープはカスタム MATLAB プログラムを使用して制御され、実験期間中、事前にプログラムされた 1 ～ 10 個の任意の電圧波形を供給しました (v. 2021a、Mathworks、Natick、MA、USA)。 波形切り替えとロボット オートサンプラーは、各ウェルに、事前にプログラムされた 1 つの電圧波形を受け取るほぼ純粋な細胞集団が確実に含まれるようにプログラムされました。 電圧波形およびフロー チップと直列の 1Ω 抵抗器の両端の電圧は、オシロスコープ (Siglent SDS1104X-E、Siglent Technologies) によって監視されました。 トランスフェクション効率、細胞生存率、および相対収率は、トランスフェクションの 24 時間後 (特に明記しない限り) フローサイトメトリーによって測定しました。

Gene Pulser 実験では、細胞を収集し、計数し、Gene Pulser エレクトロポレーション バッファー (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) で 2 回洗浄しました。 2 回目の洗浄後、細胞を同じエレクトロポレーションバッファーに 5 × 106 細胞/mL の濃度で再懸濁しました。 その後、配送される貨物を各実験に示された濃度で添加しました。 次に、細胞とカーゴを含む水溶液を 4 mm キュベット (Bio-Rad) にロードし、Gene Pulser Xcell エレクトロポレーション システムを使用して、mRNA の場合は 320 V、プラスミド DNA の場合は 360 V の単一 2 ms 方形波を使用してパルスをかけました (Bio-Rad) ）。 パルス後、細胞を、予め温めた培地を含む24ウェルプレートに直ちに移した。 トランスフェクション効率と細胞生存率は、トランスフェクションの 24 時間後にフローサイトメトリーによって測定されました。

トランスフェクション後 24 時間 (GFP 発現) または 72 時間 (TCR-α) に初代 T 細胞または Jurkat 細胞を採取し、ZE5 Cell Analyzer (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) を使用したフローサイトメトリー分析を行いました。 TCR発現は、1:50希釈のAlexaFluor 488抗ヒトTCR抗体（BioLegend、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国；カタログ番号306712）を使用して初代T細胞を染色することによって測定した。 生存率は、生存率色素 7-AAD で細胞を染色し、フロー分析の前に 5 分間インキュベートすることによって測定しました (Fisher Scientific、ハンプトン、ニューハンプシャー、米国)。 流動解析中、前方散乱（FSC）面積対側方散乱（SSC）面積プロット（図3A、Bの細胞形態）を使用して、細胞破片を排除するために細胞を最初にゲートしました。 続いて、FSC 面積と FSC 高さのプロットを使用して単一細胞をゲートしました。 生存率を測定するために、単一細胞をゲートして、7-AAD 陰性 (生) および陽性 (死) 集団の割合を測定しました (図 3A、B の生存率)。 GFP または TCR の発現を測定するために、生細胞をゲートして、ゼロ電圧コントロールと比較して緑色蛍光を発する細胞の割合を測定しました (図 3A、B の GFP)。

各データセットの独立した実験の数 (n) は、図の凡例に示されています。 すべての分析とプロットは、GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc、米国カリフォルニア州ラホーヤ) を使用して完了しました。 データは平均値 ± 標準偏差として表示されます。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者である HGC から入手できます。

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この研究の一部は、米国科学財団 (助成金 NNCI-2025233) の支援を受ける国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャー (NNCI) のメンバーであるコーネル ナノスケール施設 (CNF) で行われました。

CyteQuest, Inc、95 Brown Road、Box 1011、イサカ、ニューヨーク、14850、米国

ジェイコブ・A・ヴァンダーバーグ、トーマス・N・コルソ、スティーブン・L・レヴィ、ハロルド・G・クレイグヘッド

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概念化: JAV、TNC、SLL、HGC。 方法論: JAV、TNC、SLL、HGC; 検証: JAV; 正式な分析: JAV; 調査: JAV; 執筆—原案：JAV。 執筆 - レビューおよび編集: JAV、TNC、SLL、HGC。 視覚化: JAV; 監修：JAV、TNC、SLL、HGC プロジェクト管理: JAV、TNC、SLL、HGC; 資金調達: TNC、SLL、HGC

ハロルド・G・クレイグヘッドへの通信。

JAV、TNC、および HGC は、提示された技術に関連する特許出願の発明者としてリストされており、JAV、TNC、SLL、および HGC は CyteQuest に金銭的利害関係を持っています。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ヴァンダーバーグ、JA、コルソ、テネシー州、レヴィ、SL 他細胞治療薬製造のための T 細胞トランスフェクションを可能にする、スケーラブルな連続フロー エレクトロポレーション プラットフォーム。 Sci Rep 13、6857 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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受信日: 2022 年 7 月 26 日

受理日: 2023 年 4 月 21 日

公開日: 2023 年 4 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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